反相高效液相色谱法同时测定重楼药材中4种皂苷的含量
【摘要】目的建立RPHPLC法测定重楼中4种甾体皂苷的含量。方法采用色谱柱：Zorbax eclipse XDB C8,（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈水（40∶60），流速1.0 ml·min-1；检测波长：203 nm；柱温：40℃。 结果4种甾体皂苷范围在0.401～4.028 μg线性良好，R=0.999 6～0.999 9，回收率99.1%～103.1% 。不同来源的重楼药材中4种甾体皂苷的含量差异较大。结论 该方法准确、简捷，为重楼药材的质量控制提供了一定方法和依据。【关键词】重楼； 甾体皂苷； 反相高效液相色谱法
Abstract：ObjectiveA comprehensive analytical method based on high performance liquid chromatography-ultraviolet detection has been established for the simultaneous determination of four steroidal saponins in Paris polyphylla.MethodsThe column was Symmetry C8,mobile phase was acetonitrile-water (40∶60),UV detection was performed at 203nm.ResultsThe calibration curves showed good linearity over the range of 0.401～4.028 g, R=0.9996～0.9999,the recoveries were 99.1%～103.1% for the four steroidal saponins. The results showed that the contents of the four steroidal saponins in Paris polyphylla were different with different sources . ConclusionThe method is simple with good reproducibility and selectivity and high sensitivity ,which provides a method for quality control of Paris polyphylla.
Key words：Paris polyphylla; Steroidal saponins;RPHPLC
重楼Paris polyphylla来源于百合科（Liliaceae）重楼属植物的干燥根茎，又名蚤休、七叶一支花等。本属云南重楼Paris polyphylla var.yunnanensis和七叶一枝花P.polyphylla var.chinensis 两个变种被1995年和2000年版《中国药典》收载，其它多数种类为民间常用草药［1］。重楼是多年生草本，根状茎常肉质，呈团块状圆柱形，具有清热解毒、消肿散淤之功效［2］，是著名中成药云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁等的主要组成成分。现代药理研究表明具有止血、抗肿瘤、免疫调节、心血管作用等广泛的药理活性［3］，极具研发价值，受到广泛关注。现已从该属植物中分离鉴定出五十余种化合物，其中主要有效成分为甾体皂苷，约占总化合物数目的80%，并含有氨基酸、甾酮、蜕皮激素、黄酮苷等化合物［4,5］。活性成分重楼皂苷Ⅱ，重楼皂苷gri，重楼皂苷Ⅰ，重楼皂苷Ⅴ等，含量较高，易于检测［6］。本研究试图通过对这四种成分的含量测定，建立一种简便快速准确的高效液相色谱测定方法，为加强重楼药材质量控制提供一定方法和依据。
1仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱系统（美国Agilent 公司）：四元泵，二极管阵列检测器，自动进样器，Agilent色谱工作站。重楼皂苷对照品（纯度均高于99%）购自中科院昆明植物研究所，分别为重楼皂苷Ⅱ，重楼皂苷gri，重楼皂苷Ⅰ，重楼皂苷Ⅴ（以下顺序同，简称4种皂苷）。重楼药材来自药店采购及各地从药农处购买鲜品干燥或直接购买生药，经四川农业大学吴卫教授鉴定为重楼药材。甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：Zorbax eclipseXDBC8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（40∶60），流速1.0 ml·min-1；检测波长：203 nm；柱温：40℃。
2.2对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的4种重楼皂苷对照品各10 mg，置50 ml容量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀使浓度分别为0.2g/L，作为对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备 准确称取重楼样品粉（60目）约1 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20 ml，超声处理（功率250W，频率25KHZ）20 min，过滤，残渣用甲醇分次洗涤。重复超声3次，合并每次滤液与洗涤液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，过0.45 μm滤膜并定容至10 ml。
2.4系统适应性实验按上述方法分别对对照品溶液和供试品溶液分别进样10 μl分析，确定各成分峰位置。对照品及供试品溶液色谱图分别见图1～2。由图1可知，4种重楼皂苷的保留时间分别为17.45，20.39，21.54，25.36 min。4种重楼皂苷成分与其相邻峰均达基线分离。样品中杂质对重楼皂苷的测定基本无干扰。
图1对照品HPLC图（略）
图2样品5HPLC图（略）
2.5线性关系精密吸取对照品溶液2，5，10，15，20 μl进行测定，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。回归方程及线性范围如下。
表14种甾体皂苷线性方程及范围（略）
2.6精密度实验 精密吸取上述对照品溶液10 μl，重复进样5次，测得4种重楼皂苷成分峰面积积分值RSD分别为0.27%，0.46%，0.22%，0.60%。
2.7重现性实验 取同一供试样品，分别进行供试品溶液的制备、测定，重复6次，4种重楼皂苷含量的RSD分别为0.84%，3.15%，0.97%，1.24%。 2.8稳定性实验 供试品溶液自制备之日起按色谱条件进行测定，0，4，8，12，24，48，RSD均小于2%，结果表明4种重楼皂苷在48 h内均较稳定。
2.9回收率实验 采用加样回收法，取已知含量的重楼样品，分别添加4种对照品，按上述方法进行供试品溶液制备、测定，4种重楼皂苷平均回收率（n=3）依次分别为99.1%，101.0%，103.1%，99.6%。
2.10样品含量测定用本法对17个不同产地的重楼药材中4种重楼皂苷进行含量测定，结果见表2，不同来源样品中各成分含量差异较大。其中购自重庆巴南的样品重楼皂苷Ⅱ含量最高，达5.03 mg/g；山西稷山、四川南充和四川峨眉的样品中未检测出重楼皂苷Ⅱ。蒲江长秋采集鲜品干燥者中重楼皂苷gri，重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ含量均为最高，分别为35.73，12.71，3.48 mg/g；安徽蚌埠的样品中重楼皂苷gri和重楼皂苷Ⅰ含量均为最低，且未能检测出重楼皂苷Ⅴ。
3讨论
由于重楼中甾体皂苷溶于水产生大量泡沫，给提取带来困难，所以采用甲醇提取简单易行，提取效果也较好。超声提取中，反复3次已经可以提取完全，并且溶液温度不至于过高。采用C8柱进行试验，检测时间短，各组分分离完全。流动相中乙腈与水的比例大于40∶60时，出峰时间较晚，不易于检测；小于40∶60时出峰太早，各组分分离不完全，所以采用此比例较合适。结果表明，相比于皂苷元的提取方法［6～9］，本方法简单易行，需时较短，对于快速测定重楼药材中主要药用成分皂苷含量具有很好的可操作性。适宜快速鉴别重楼药材真伪及检测重楼药材药用成分含量。
表2样品含量测定结果（略）
表中在各地采集的平鲜品干燥者除2号样品为云南昆明植物研究所张德全采集外，均分别从当地药农处购得，这些药材在当地均销住药店作重楼药用；n=3
对不同来源地的重楼药材中4种甾体皂苷的检测，结果表明不同来源地重楼中各成分含量差异较大。推测其原因，认为除可能与不同来源重楼药材生长的生态环境、采收年限、采收季节、加工方法、贮藏方法和年限等不同有关外，也可能与各地重楼药材来源于重楼属不同物种，或即使来源于重楼属相同物种，但同一物种不同居群间遗传背景等也存在一定差异有关。由此，今后应进一步加强重楼药材的种质资源以及生产和加工的规范化技术研究，以确保重楼药材用药质量的优质、稳定和可控。本实验结果还表明，四川蒲江样品3种皂苷含量显著高于其他样品，可能与该样品生长年限长，有利于部分皂苷成分的积累有关。此外，与直接采集鲜品干燥者相比，购自药店的生药及饮片中多数不能同时检测到4种成分，推测生药饮片的贮藏和炮制方法对药材中有效成分含量的影响较大。
【参考文献】
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