灵芪蠲肝液对肝纤维化细胞外基质的作用研究
作者：李万平 李晓冰 黄新武【摘要】目的通过动物实验研究灵芪蠲肝液对细胞外基质的影响。方法四氯化碳溶液复制肝纤维化模型，取血测定纤维化指标透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（P—CIII）、IV型胶原（CIV）；测定10%肝匀浆中羟脯氨酸（Hyp）含量；并取肝组织做病理检查。结果四氯化碳慢性肝损伤时，灵芪蠲肝液可降低HA，LN，PSIII，CIV，Hyp，与模型组比较差异有显著性（P<0.05）；病理发现能减轻肝脂肪变性、减少纤维组织增生、促进肝细胞再生。结论 灵芪蠲肝液能调节肝纤维化细胞外基质代谢，减少细胞外基质沉积，从而减轻肝纤维化。
【关键词】灵芪蠲肝液 肝纤维化 细胞外基质
Abstract：ObjectiveToobserveeffectsofLingQijuanGan Liquor(LQL)on extracellar matrixin rats with hepaticfibrosis.MethodsThe modelofhepatic fibrosis was inducedbycarbontetrachloride . The changesofserum fibrosis index hyaluronisacid(HA),laminine(LN),prosollagenⅢ(PCⅢ),collagenⅣ(CIV)and hydxy-proline(Hyp)in liver homogenates were measured.Liver tissues were taken to do pathological examination.ResultsCompared with modelgroup,LQL could notably reduce HA,LN,PCⅢ,CIV and Hyp when liverswere chronic damaged,the differences werestriking(P<0.05).Pathol examinationfoundthatLQL could lightendenaturalizationofliverfatand reduce hyperblasia offibroustissueandacceleraterebirthoflivercell.ConclusionLQLcanmodulatethemetabolism ofECMandreducesedimentofECMandthenalleviatehepatic fibrosis.
Key words：LingQiJuanGan Liquor；Hepatic fibrosis；ExtracellularMatrix(ECM)
中医认为正气虚弱是肝纤维化发生的主要原因，染病后发病与否取决于机体正气强弱，正气不足，不能驱邪外出，则邪气潜藏。现代观点认为肝细胞坏死，炎症激活肝脏内Kupffer细胞，内皮细胞等，使其释放各种细胞因子（如转化生长因子β1，血小板衍生生长因子），细胞因子进一步激活静息状态的星状细胞（HSC）过度增殖，同时大量合成各种细胞外基质（ECM），ECM过度沉积而导致肝纤维化［1］。阻断肝纤维化的发生和发展，对防治慢性肝病和肝硬化具有重要意义。灵芪蠲肝液为中药灵芝、黄芪、当归、大青叶等的水提物，具有抗炎、防止纤维化、增加免疫力等功效。本实验旨在研究灵芪蠲肝液对肝纤维细胞外基质的影响，探讨灵芪蠲肝液的作用及机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1药品与试剂灵芪蠲肝液（LQL），17 g（生药）/20 ml;肝苏颗粒，17 g（生药）/包，由四川郎中药业有限公司生产，批号：040330。四氯化碳，临用时溶于植物油中，配成40%的四氯化碳溶液，由四川成都化学试剂厂生产，批号20010919。戊巴比妥钠，Serva进口分装，批号：800603。Hyp,HA,LN,PCIII,CIV试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供，批号20040421。
1.1.2动物Wistar雄性大鼠112只，体重180～220 g。由泸州医学院实验动物科提供，一级动物，合格证号240115。
1.1.3仪器52型紫外可见分光光度计，上海青华科技仪器有限公司。全自动酶标仪，美国生产，ELX808型。摄影生物学显微镜，日本OLympus,BH2型。
1.2方法
1.2.1造模及给药取大鼠112只，随机分成6组，即空白对照组，模型组，灵芪蠲肝液大、中、小剂量组（LQL1，LQL2，LQL3），肝苏颗粒阳性对照组（GSKL），其中空白对照组12只，其余各组20只。灵芪蠲肝液大、中、小剂量组分别为8.5，4.25，2.125 g(生药)·kg-1(相当于临床用量的10，5，2.5倍)，用等容量灌胃给药。为排除灌胃对动物食欲的影响，模型组和空白对照组给予等量蒸馏水。对3剂量组、阳性对照组和模型组给予大鼠皮下注射40%的四氯化碳溶液3 ml·kg-1，2次/周，连续10周。药物治疗于给四氯化碳后4周后开始，晨灌胃1次/d，连续6周，观察动物的一般情况。于末次给约24 h后，每组取10只大鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，心脏取血3 ml，检测血清HA，LN，PCIII，CIV；取肝制成10%的匀浆，测Hyp。每只大鼠取同一部位的肝脏做病理切片。HA，LN，PCIII，CIV，Hyp均按试剂盒说明具体操作。
1.2.2统计处理计量资料以±s表示，用SPSS10.0软件进行统计分析，行单因素方差分析，SNK法组间均值两两比较。检验水准a=0.05。 2结果
2.1动物一般情况实验期间，空白对照组大鼠一般状况良好，模型组大鼠于第4周开始出现精神萎靡、背弓、皮毛蓬松，并开始出现死亡，解剖可见腹腔积液，早期死亡者可见肝脏花斑样改变，晚期死亡者肝色苍白、质硬，死前肛周潮湿，体形消瘦，治疗组有所改善，但亦有死亡情况。
2.2灵芪蠲肝液对血清肝纤维化指标的影响结果见表1。
表1灵芪蠲肝液对血清肝纤维化指标的影响（略）
与正常对照组比较，*P＜0.05，与模型组比较,#P＜0.05
2.3灵芪蠲肝液对CC14肝纤维化肝匀浆Hyp的影响结果见表2。
表2灵芪蠲肝液对肝匀浆Hyp的影响（略）
与正常对照组比较，*P＜0.05，与模型组比较，#P＜0.05；n=10
2.4肝组织病理学检查肉眼观察，模型组与小剂量组颜色灰白，质较硬。显微镜下，空白对照组肝细胞结构清楚，无细胞变性、坏死和纤维组织增生。模型组肝组织结构部分破坏，可见肝细胞脂肪变性、水变性及灶性坏死，有较明显纤维组织增生，甚至有部分区域有假小叶形成；灵芪蠲肝液大、中剂量组脂肪变性轻微，见少许纤维组织增生并促进肝细胞再生；灵芪蠲肝液小剂量组及阳性对照组肝组织灶性破坏，肝细胞变性、肝纤维比较模型组稍轻。见图1～3。
图1正常对照组HE染色（×100）（略）
图2模型组（×100）（略）
3讨论
CC14对肝毒性损伤主要是由于经肝细胞微粒体细胞色素代谢裂解成三氯甲基自由基（CC13-），CC13-可进一步经氧化反应形成更强反应活性的基团，从而产生脂质过氧化作用，破坏肝细胞的膜性结构［2］。CC14致肝纤维化是经典模型，可重复性强。
图3灵芪蠲肝液大剂量组（×100）（略）
肝纤维化的实质是由于胶原和其他细胞外基质（ECM）在肝内过量沉积［3］。PCIII，CIV，HA，LN在肝纤维过程中发挥重要作用，联合检测PCIII，CIV，HA，LN是判断慢性肝病患者有无纤维组织增生的敏感指标［4］。羟脯氨酸（Hyp）为胶原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝脏含量可反映胶原代谢的变化情况，与肝纤维化程度平行。CCl4肝纤维化实验中，模型组PCIII，CIV，HA，LN及Hyp都明显增高，因反复的损伤刺激，使HSC（又称贮脂细胞）激活增生，ECM合成增多或基质金属蛋白酶的活性降低对ECM降解减少而过度沉积所致。灵芪蠲肝液能降低PCIII，CIV，HA，LN及Hyp，且病理结果显示其能减少纤维组织增生，表明灵芪蠲肝液能减少ECM合成或增加降解，调节ECM代谢，减少ECM的过度沉积而减轻肝纤维化程度，从而延缓肝纤维化的进程。
组方中的灵芝、黄芪、当归、大青叶等都具有扶正固本的作用，有利于驱除邪气而缓解症状。
【参考文献】
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