皱瘤海鞘正丁醇部位体外抗乙肝病毒的初步研究
【摘要】目的对皱瘤海鞘正丁醇部位进行抗乙肝药效筛选。方法应用酶联免疫技术(ELISA)测定血清中病毒与药物反应12h前后表面抗原(HBsAg)、e抗原 (HBeAg)的OD值变化，评价皱瘤海鞘正丁醇部位抗乙肝病毒(HBV)的活性。结果在药物浓度大于6mg/ml时，给药组与对照组中HBsAg，HBeAg的OD值在统计学上有显著性差异（P<0.05），提示皱瘤海鞘正丁醇部分有明显的抗HBsAg和HBeAg作用。结论 初步提示皱瘤海鞘正丁醇部位对乙肝病毒有抑制、破坏作用。【关键词】皱瘤海鞘 抗乙肝病毒 酶联免疫技术
Abstract:ObjectiveTo screen out the anti-HBV effective parts extracted from Styela plicata using n-butanol as solvent.Methods The OD changes of HBsAg，HBeAg in serum added drug were measured by ELISA in 12h, and antiHBV effective parts from Styela plicata were evaluated. ResultsThe OD changes of HBsAg and HBeAg had significant differences between team added drug and non-drug team(P<0.05) in concentration above 6mg/ml.The parts extracted from Styela plicata using n-butanol revealed anti-HBsAg and anti-HBeAg effects. ConclusionThe n-butanol parts ofStyela plicata have antiHBV effect.
Key words：Styela plicata; AntiHBV；ELISA
海鞘(Ascidian)是尾索动物亚门(Uronordata)海鞘纲的尾索动物，在我国南海有着丰富的资源。20世纪80年代以来，研究已表明海鞘中含有许多生理活性的化合物［1～3］，包括生物碱类、肽类、多硫化物、大环内酯、萜类等。我中心较早开展皱瘤海鞘抗乙肝的研究，现已初步证实皱瘤海鞘醇提物有一定体内抗乙肝药效［4］。笔者拟从有药效的醇提物部分进行分离，得到正丁醇部分，并对该部分进行体外抗乙肝病毒药效学初步筛选，以确定海鞘正丁醇部位对乙肝病毒是否有抑制作用。
1材料与仪器
皱瘤海鞘(采自广东大亚湾海域，样本经国家海洋局厦门第三海洋研究所郑成兴研究员鉴定，标本保存于第一军医大学药剂研究中心，采集日期20060329)； HBsAg，HBeAgELISA检测试剂盒(上海荣盛生物工程公司，批号20051230)；带病毒血清(广东省第二人民医院检验科，采集日期20061020)；其它试剂均为分析纯；∑960酶标仪(台湾METERTECHINC公司)。
2方法
2.1 皱瘤海鞘正丁醇部位的制备取去内脏皱瘤海鞘10 kg，用10倍体积的95%乙醇浸泡14 d，溶液过滤，滤液减压回收乙醇，水浴蒸干得200 g醇提物，取100 g，用700 ml双蒸水尽量溶解，用等体积水饱和正丁醇萃取，并浓缩蒸干，得正丁醇初提物4.3 g。
2.2体外抗HBeAg筛选 将“大三阳”血清（血清中同时含有HBsAg和HBeAg)分别以50 μl/孔加入96孔板内，另取以上实验得到的正丁醇部位，用生理盐水配制成12 mg/ml的母液，并相应稀释成2，4倍，即为6，3 mg/ml。每个浓度各50 μl加入于96孔板中，每个5孔，分别与血清在37℃恒温箱中作用12 h后取出，按照试剂盒中说明书操作，于450 nm/630 nm双波长测定各孔血清中HBeAg的OD值。实验另设不加药加生理盐水50 μl/孔做阳性对照组，同时以正常人血清按相同条件与生理盐水作用的反应液为阴性对照，以生理盐水为空白对照。
2.3体外抗HBsAg筛选同2.2项下操作，只是将带毒血清换成“小三阳”血清（即血清中仅含有HBsAg）。 3 结果
采用∑960酶标仪测定各组OD值，运用SPSS 10.0软件进行方差分析，可知正丁醇部位对带病毒血清中HBeAg，HBsAg有无抑制作用（见表1）。抑制率=（阳性对照OD值-给药组OD值）/（阳性对照OD值-阴性对照OD值）
从表1看出，正丁醇部位浓度在12，6 mg/ml时，药物组与对照组OD值有显著性差异（P<0.05），HBeAg抑制率分别是90.11%，73.63%，HBsAg为58.33%，41.67%，说明药物对HBeAg，HBsAg均有抑制作用；在3 mg/ml时，仅对HBsAg有抑制作用（抑制率29.63%），而HBeAg没有抑制作用。
表1皱瘤海鞘正丁醇部位不同浓度对HBeAg，HBsAg的作用（略）
药物不同浓度组与HBeAg阳性对照组比较，*P<0.05；药物不同浓度组与HBsAg阳性对照组比较，**P<0.05
4讨论
从表1中得到的结果提示，皱瘤海鞘正丁醇部位在体外对血清中的HBeAg，HBsAg有明显的直接破坏作用，具有一定的抗乙肝药效，该提示为进一步分离、提取正丁醇部位中有效单体成分提供了药效指引。我们对正丁醇部位进行了成分预实验，发现该部位有辛辣味，并且Liebermann-Burchard反应呈阳性，提示其中可能含有皂苷类成分，需要进一步进行分离提取。
抗乙肝有效成分的体外筛选方法有很多［4，5］，国内常利用转染HBV病毒基因的2.2.15细胞进行体外筛选，但该种方法操作较复杂，对环境要求比较严格，且实验周期较长，而本文所采取的方法具有操作简单、实验时间短的优点，适合于大批量地进行体外抗乙肝药物的初步筛选。本方法也有一定的局限性，只能提示正丁醇部位在体外具有抑制乙肝病毒的药效，并不能说明其抗乙肝的作用机制，只能对分离提纯提供初步的药效指引。
【参考文献】
［1］ 董肖椿，闻 韧.海洋生物碱eudistomin U及其衍生物的研究［J］.中国药物化学杂志，2003，13（2）：67.
［2］ 耿 越，张 薛，赵相轩.海鞘类天然产物的最新研究进展［J］.天然产物研究与开发，2001，13（6）：73.
［3］ 倪学文.海洋抗病毒活性物质的研究进展［J］.中国热带医学，2006，6（5）：871.
［4］ Rui wang，Zhan-Lan Du,Wen-Jun Duan et.Antiviral treatment of hepatitis B virus-transgenic mice by a marine organism, Styela plicata［J］.World Journal of Gastroenterology,2006,12(25)：4038.
［5］ 叶 人.中草药抑制乙肝病毒(HBV)实验研究进展［J］.中药材，1999，30(9)：715.
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