植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展
【摘要】利用植物细胞培养生产代谢产物具有十分广阔的前景。文章就植物细胞培养生产次生代谢产物过程中各种理化条件优化以及植物细胞培养过程相关模型建立的研究进行了综述。【关键词】植物细胞培养 条件优化 模型
植物细胞培养始于本世纪初，并不可争议地具有工业化潜力。目前植物细胞培养生产的化合物很多，包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物，植物细胞培养的应用主要包括以下3个方面：有用物质（次生代谢产物）的生产；植物无性系的快速繁殖和遗传突变体的筛选；植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的深入研究。但是由于植物细胞大规模培养技术的局限性使得植物细胞仍难以实现大规模工业化生产，迫切需要进一步研究和发展细胞培养条件的优化控制及其工艺。目前，世界上众多研究工作集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高目标产物的产率并保证其生产稳定性上。
1植物细胞悬浮培养条件的优化
1.1植物细胞培养过程中物理因素的优化控制对于植物细胞培养来说，环境中的许多物理因素对细胞的生长以及目标次生代谢产物的合成具有很大的影响。如通过温度、光照、电场、磁场电磁辐射、机械力以及超声波等对于植物细胞培养过程都有着十分重要的作用。植物细胞的生长、繁殖和次生代谢物的生产需要一定的温度条件，在一定的温度范围内细胞才能正常生长、繁殖和维持正常的新陈代谢，植物细胞培养的最适温度一般为25℃，但不同的植物种类略有差异，而且植物细胞生长和次生代谢产物的合成所需的温度并不一致，因此选择合理的培养温度并进行相应的调控对于细胞生长以及产物合成十分关键，H.J.G.ten Hoopen等［1］曾对Catharanthus roseus细胞的培养过程、Toshiya Takeda等［2］对Strawberry细胞的培养过程分别进行温度的阶段性调控，结果都在很大程度上提高了产物的产率；培养基的pH值与细胞生长繁殖以及次生代谢产物的生产关系密切，与培养温度相似，细胞的生长繁殖与次生代谢产物合成时所需的pH值通常并不一致，需要在不同的阶段控制不同的pH值；目前关于电场的作用机理膜周电泳学说，该学说认为对细胞施加稳定的电场能够导致膜中带电物质的重新分配，最终导致原生质体生长和分化效应。石贵玉等［3］曾对银杏细胞培养细胞施加一定的高压电场进行刺激，结果发现对细胞的相关指标产生了较大的影响；而磁场的作用机理使它加速了细胞内的氧化磷酸化过程，从而促进ATP的合成，最终使得有丝分裂指数增高。王曼丝等［4］和洪丽萍等［5］分别研究过磁场对滇紫草细胞培养过程的影响；有研究表明［6］宇宙中的电磁波对生物体都会产生巨大的影响；超声波的运用主要是有利于细胞次生代谢物向细胞外释放。目前在这些方面的一些研究主要还是停留在机理的探讨上，而如何在细胞大量培养时综合利用并对这些因素进行调控还有待进一步的研究。
1.2植物细胞培养过程中化学因素的优化控制植物细胞培养过程中的一些化学因素如培养基组成、溶氧、其它添加物等对于细胞的生长也具有十分重要的意义。合理的培养基组分、适当的溶氧以及其它诱导子及其前体等物质的有效调控能够在很大程度上促进细胞的生长以及次生代谢物的合成。培养基中的碳源、氮源及其一些微量的金属离子以及一些有机物质不仅是细胞生长以及合成的物质基础，而且很多都能够促进细胞生长或者是有利于产物的形成。植物细胞培养通常使用蔗糖作为碳源，研究表明，一定浓度的蔗糖不仅能够促进植物细胞的生长，还能够刺激次生物质的合成，Fujita等采用4%（W/V）的蔗糖浓度培养紫草细胞，结果仍能提高花色素的产量，Venkatesh等通过交替流加碳、氮源紫草宁的实验发现，在一定范围内，碳源浓度的提高有利于色素的产生，但当蔗糖浓度大于5%时，对紫草宁的合成开始产生抑制作用；氮源的主要作用是促进细胞分裂，合成蛋白质与核酸等细胞物质，培养基中的氮源可分别以［NH4+］和［NO3-］的形式存在，氮源浓度有最佳范围，而［NH4+］/［NO3-］的浓度比对细胞的生长代谢也非常重要；其它一些金属离子以及一些有机诱导子的添加也会对培养细胞的生长以及次生代谢产物的合成产生影响；在植物细胞悬浮培养中，溶氧对细胞的生长和代谢有很大的影响［7，8］，同时，在培养条件中溶氧也是最复杂的因素之一，溶氧有一定的极限，过高或过低都会影响到细胞生长和产物合成，特别是在高密度培养时，供氧不足往往可能是限制产量的主要因素之一，因此溶氧参数的调控对于植物细胞培养十分关键，Jin-Han等研究了氧分压对Panax notoginseng培养细胞生长以及人参皂苷和多糖合成的影响，发现高的氧分压抑制细胞生长，同时也不利于产物的合成。
2植物细胞培养相关模型的研究进展
利用植物细胞培养生产药物，已发展成植物细胞培养在生产运用中的主流之一。目前全世界约有四分之三的人以植物作为预防疾病的药物来源。因葡萄球菌、大肠杆菌、结核杆菌等都表现出对由微生物来源的各种抗生素的耐药性，人们对抗生素类药的局限性已有了深刻的认识。植物产生的药物在微生物中很少发现，而且植物产生的药能克服微生物来源药物的诸多不足，而化学合成药物的难度又远远超过了从植物中获得天然产物。然而由于药用植物的过度采伐，其资源日趋贫乏，同时对环境也造成了极大的破坏，因此为了解决植物资源短缺、环境保护等问题，药用植物细胞的大量培养显得十分重要。目前国内外在药用植物细胞培养方面的研究取得了很大进展，特别是运用生物反应器进行药用植物细胞大量培养的技术正日趋成熟。在植物细胞放大培养的过程中最关键的问题是建立对培养过程中各种现象进行合理描述的模型, 为细胞的大量培养奠定基础。目前国内外在植物细胞培养过程动力学模型的研究方面取得了很大的进展。植物细胞培养始于20世纪初, 运用生物反应器对植物细胞进行大量培养的报道最初始于1960年，Tuleche和Nickel运用134L的生物反应器成功培养了不同种类的植物。但由于植物细胞固有的性质代谢途径和代谢产物与细胞生长关系的复杂性，细胞与培养环境相互作用，使得对植物细胞的放大培养变得难以实现，只有针对不同的植物细胞，采用相应的简化策略建立细胞培养模型，逐级模拟和优化培养过程才能够最终实现细胞的大量培养。现分别就近几年关于植物细胞培养过程的动力学模型的研究进展进行归纳。
2.1植物细胞培养非结构化动力学模型最初植物细胞培养的数学模型的建立是在细菌等微生物培养过程动力学模型的基础上发展起来的。在传统的微生物发酵过程中通常都是以一个简单的生物量组分来进行模型化，因此都是非结构化的，如Monod模型、Nyholm模型及其Leudeking-piret模型等，这些类型的模型通常都只能够考虑一些单组分的变化情况，而不能够考虑到植物细胞组分的多样性和细胞在培养过程及其代谢过程中变化的复杂性，如次生代谢产物的生成和细胞生长以及细胞在代谢过程中其它中间物质之间的相互转化的复杂关系等。因此这类模型不能够预测植物细胞培养过程中的很多行为，对于植物细胞的放大培养的指导性也十分有限。 2.2植物细胞培养结构化动力学模型随着对植物细胞培养过程的研究深入进行以及对植物细胞代谢过程的明朗，植物细胞培养的多样性也有了较多的认识，从而开始运用复杂的数学模型——结构化数学模型——来描述植物细胞的培养过程。由于结构化数学模型考虑了培养细胞组分的多样性及其之间以及细胞与环境之间的生理生长关系，因此能够较精确地描述植物细胞的培养过程。这类模型对于分析细胞内的代谢调控很有价值，能够为培养过程提供更加清晰、更加定量的依据，其分析结果对于进行细胞培养过程的优化具有较强的指导性。到目前已经有4种结构化数学模型运用于植物细胞培养的研究之中：
第一类模型是由Frazier等在1987年提出了一个基于两种代谢中间物的动力学模型，用于解释细胞生长及与生长相关的产物合成之间的相互作用，1989年他又提出植物细胞处于细胞团的小环境中，其生长受中间代谢物控制的模型，该模型预测在细胞生长过程中存在一个延迟期。这类模型关键在以细胞培养中间代谢产物的生成和释放行为为建模依据建立模型来解释细胞生长及与生长相关代谢产物之间的关系。
第二类模型把细胞的存活率引入了建模中，分析了细胞活性与细胞生长、底物消耗以及代谢产物的形成之间的相互关系。在1989年Bailey和Nicholson提出了一个新的模型，在这个模型中考虑了细胞鲜重和存活率两个新的变量，这种模型能够预知细胞的膨胀和溶解过程。1990年Mathisca 等［9］又提出了一个能够区分分裂细胞和非分裂细胞的生长模型。到1998年，在Bailey和Nicholson提出的模型的基础上，Glicklis［10,11］在假设只有存活细胞生成产物多糖，底物消耗不用于维持细胞生长的前体下提出了一个植物细胞悬浮培养生成多糖的动力学模型，并通过Symphytum officinal L.的悬浮培养确定其多糖的合成属于生长相关型。
第三类模型属于考虑底物吸收及其活化机制的结构化模型。1992年Brian S. Hooker 和James M. Lee以细胞吸收培养基中的物质蔗糖等以及其在细胞内的代谢为基础, 通过一定的假设和简化,建立了考虑细胞生长、产物生成以及细胞呼吸作用的结构化数学模型，通过对细胞结构化的组成物、次生代谢产物的形成和细胞呼吸作用的检测来研究细胞在培养过程中内部的相互作用，并且将生长竞争型和非生长竞争型次生代谢产物区分开来。这个模型第一次说明了底物吸收和活化机制，模型的预测与实验有一定的相符合性。在2000年薛莲等［12］以培养基中碳源在培养过程中所经历的途径为依据，建立了紫草细胞悬浮培养的结构化动力学模型来描述细胞的培养过程，参数优化的结果使模型能够较好的反映培养体系的变化情况。这种结构化模型较之Hooker等建立的模型更加简单，而且参数较少容易检测，有较强的实用性，在2003年李踳等［13］也以同样的方法对红豆杉细胞培养建立了相应的模型，其实验结果也证明了该模型能很好的描述培养过程，通过对两种细胞培养建模的成功实现证明了该模型对于植物细胞培养存在一定的通用性。
第四类模型主要考察了在细胞培养过程中其它重要盐类物质如磷酸盐和钙盐等对细胞培养生长或产物形成的影响。1993年Guliklis等［14］提出了一个关于长春花细胞在不同磷酸盐水平下进行分批培养的结构化模型，模型不仅成功的描述了批式培养时细胞在不同磷酸盐浓度下的生长情况，而且对细胞在恒化器中的培养情况也有较好的预见性。Bramble等也提出了一个考虑钙盐和磷酸盐对咖啡细胞悬浮培养的影响的结构化模型，能够预见生物碱的形成速率，与实验结果具有很好的一致性。1999年,许建峰等［15］以磷酸盐与细胞生长和代谢产物的生产的关系建立了高山红景天致密愈伤组织颗粒悬浮培养的结构化动力学模型, 该模型能够计算并预测接种量、接种无“年龄”及培养基中初始磷酸盐浓度对高山红景天致密愈伤组织生长与红景天甙的影响，模型能够基本上反映高山红景天致密愈伤组织悬浮培养的动力学规律。
2.3植物细胞培养人工智能仿真模型最近由于计算机技术的突飞猛进，特别是其在生物学中的运用，使得计算机技术在细胞培养中的运用也有了很大的进步。因为植物细胞在培养过程中因素众多，各种因素对细胞培养的影响也是交错复杂，很难精确地运用纯粹的数学方法进行描述和优化，而运用计算机技术进行人工智能仿真模拟能够弥补数学方法的不足。作者在对怀槐细胞培养过程中，为了考察氮源和激素对培养细胞生长和产物异黄酮合成的影响，运用神经网络和实数编码的加速遗传算法对过程进行建模并进行模型参数优化［16］，模拟结果与实验结果具有很好的一致性，而且优化的氮源和激素组合使得培养细胞的异黄酮产率较对照有很大的提高。
3植物细胞生物反应器培养
自从1960年Tuleche和Nickle首次报道在134L生物反应器中成功培养不同植物种类以来，利用植物细胞大规模培养技术为植物有用代谢产物的生产提供了有效途径和生产方法。由于植物细胞固有的性质，如细胞容易聚集、细胞分化、细胞十分脆弱以及代谢途径和代谢产物形成与细胞生长关系复杂，因此在植物细胞培养时选择合适的反应器类型及操作方法极大地关系到植物细胞代谢产物的合成。
利用生物反应器来培养植物细胞相对与利用摇瓶来讲有两大优势,首先可以更好的控制反应系统(比如pH值和溶氧浓度可以在线监控等)；第二点优势在于许多生物反应器可以放大，可以更好的运用于大规模的工业化生产。运用于植物细胞培养的生物反应器主要有：搅拌式反应器、气升式反应器、鼓泡式反应器、膜反应器、光照培养反应器和转鼓式反应器等。各种反应器都有自身的特点和优点，在选用反应器时要根据不同的植物细胞特点选取相应的反应器类型。在运用反应器培养植物细胞时反应器的操作策略也是多样的，如间歇培养、流加操作、连续培养和两段培养等。但在反应器培养时主要考察的参数是系统的溶氧速率以及其调控方式的优化。
4展望
虽然通过植物细胞培养生产药用成分取得了很大的进展，目前已经研究过的植物有400多种，能够生产超过600多种的成分，其中有相当大部分具有药用价值，而且也有不少成功实现工业化生产的实例，如日本实现的紫草细胞培养生产紫草宁、人参细胞培养生产人参皂苷以及黄连细胞培养生产黄连素等。但药用植物细胞大量培养的研究还有很多关键性的问题没有得到根本性的解决，始终制约着药用植物细胞培养实现工业化生产的进程，这其中最主要的问题还是如何建立出适合不同植物细胞培养体系优化和放大的模型。因此对于植物细胞培养过程进行建模以及细胞培养规模放大的研究仍然是一项十分有意义而又艰巨的研究任务。
【参考文献】
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［3］石贵玉，周巧劲，张振球，等.电场对银杏愈伤组织生长的影响［J］.生物物理学报，1999, 15(3): 547.
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