amy54321 发表于 2014-8-19 22:12:23

同一品种不同产地宁夏枸杞DNA指纹图谱特征研究

【摘要】目的探讨同一品种不同产地宁夏枸杞DNA指纹图谱特征。方法采用RAPD技术对全国四大商品区的枸杞道地品种宁夏枸杞的主栽品种宁杞1号的叶片和宁夏商品区的制品枸杞子进行了DNA指纹图谱特征研究。结果 四大商品区的宁夏枸杞叶片DNA指纹图谱一致,而制品枸杞子的DNA指纹图谱与叶片的有较大差异。结论DNA指纹图谱用于鉴定同种枸杞的叶片结果可靠。

【关键词】宁夏枸杞 多态性 DNA指纹图谱

  Studies on the DNA Fingerprints of Lycium barbarum L. from Different Area

  Abstract:ObjectiveTo study the DNA fingerprints of Lycium barbarum L. obtained from different areas. MethodsDNA fingerprints of samples of leaves and fruits of Lycium barbarum L. from four large commercial centers were examined by RAPD. ResultsAll leaves of Lycium barbarum L. showed similar fingerprints characteristics, while the fruits of Lycium barbarum L. gave considerable different results. ConclusionDNA fingerprint study is reliable for identifying Lycium barbarum L..

  Key words: Lycium barbarum L.;RAPD;DNA fingerprint

    用任意引物进行基因组指纹分析是检测DNA多态性的一种通用方法,这种方法是用随机选择的引物在一定反应条件下产生DNA指纹,这样获得的指纹有的只包括几个主要的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,简称PCR)产物,有的则包括100多个,这样的产物通常被称为随机扩增的多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,简称RAPD)。RAPD由Williams和Welsh两个研究小组几乎同时于1990年建立起来的一项DNA分子标记技术[1,2],其原理是:它以一个10碱基的任意序列的寡核苷酸片段为引物在未知序列的基因组DNA上进行随机的PCR扩增,这种被DNA聚合酶调节的扩增是一个复杂的、动态的化学反应系列;在这些反应中引物将同源序列从非同源的竞争位点识别出来并确定以后的效率,模板、扩增产物、酶、引物与dNTPs浓度之间的平衡随每个温度周期而变,不同种类的分子彼此相互作用,其结果是合成了PCR扩增产物;在基因组上,某一引物可能会与单链DNA的多个位点结合,但只有这些引物的位置是在彼此可扩增的距离内(200~4 000 bp),一组不连续的分子量为200~4 000 bp的DNA片段就会通过PCR产生;如果双链DNA分子在一定长度内具有反向平行又与引物互补的片段,那么经过40个循环后就可以合成240条新链,如此高产的DNA片段经电泳分离和溴化乙锭专一染色后可直接在紫外光下观察和照相,记录下RAPD指纹[3]。

    前文已报道过RAPD法对枸杞叶片基因组DNA进行指纹图谱分析[4]。本文在此基础上,对全国同品种不同产地宁夏枸杞主栽品种宁杞1号的DNA指纹图谱特征进行了研究。

  1材料

    本实验采用了全国四大商品区的枸杞道地品种宁夏枸杞的主栽品种宁杞1号的叶片和宁夏商品区的制品枸杞子(表1),旨在探求同种药材不同产地及同一产地枸杞叶片、制品枸杞子的DNA指纹图谱特征。表1实验材料(略)

  2仪器与试剂

    PCR仪(PTC-200TM Peltier Thermal Cycler,M J Research,Inc,USA);电泳仪(DYY-10C型;北京六一仪器厂);电泳槽(DYCp-31型;北京六一仪器厂);SmartSpecTM 3000核酸蛋白测定仪(BIO-RAD Lab,Inc,USA);Eppendorf 5415D离心机;UVP GDS-8000凝胶成像系统。

    Buffer,Taq DNA 聚合酶,dNTPs、MgCl2,300 bp DNA ladder购自北京天为时代公司,10碱基随机引物购自上海生工生物工程有限公司,Agarose(Promega公司),EB(瑞士Fluka Chemika公司)。

  3方法

  3.1基因组DNA提取叶片基因组DNA提取根据严奉坤等[1]的提取法进行。枸杞子基因组DNA提取根据郑可大[5]等的提取法加以改进,具体步骤如下:①取枸杞子1 g置液氮中研磨成粉末后装入25 ml的加盖离心管中,加入10 ml预热至65℃的2×CTAB提取缓冲液(2%CTAB,1.4 mol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,100 mmol/LTrisHCl(pH8.0), 0.2%β巯基乙醇)混匀,65℃温育30 min,取出立即放入冰中冷冻10 min。②加入10 ml的氯仿异戊醇(24:1),混匀,于4℃冰箱中冷冻10 min,12 000 r/min离心10 min,转移上清液于干净的10 ml的加盖离心管中,重复一次。③加入1 ml预热至65℃的的10%CTAB缓冲液(10%CTAB,0.7 mol/L NaCl)于上清液,用氯仿异戊醇(24:1)再抽提一次,加入10 ml的1×CTAB沉淀缓冲液(1%CTAB,10 mmol/L EDTA pH 8.0,50 mmol/L Tris-HCl pH8.0)于-20℃下静置20 min。1 200 r/min离心15 min,弃上清液,先加入70%乙醇洗沉淀两次去除有机溶剂和无机盐,然后加入无水乙醇脱水,室温干燥。④将干燥DNA溶解于200 μl的ddH2O或0.1×TE缓冲液做母液于-20℃储存。将DNA母液取出10 μl稀释40倍后,用SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪测波长260,280及320 nm处光吸收,直接从仪器主屏上读出被测样品A260,A280,A260/A280和DNA含量。点6×上样缓冲液10 μl于玻璃板上,分别吸取各材料DNA母液2 μl与其混匀,然后在0.8%琼脂糖凝胶上电泳(72v电压下电泳30 min),检验DNA片段大小。最后将DNA母液稀释为25 ng/μl的工作液分装成小包装于-20℃储存或4℃保存备用。  3.2PCR扩增及电泳检测反应在PTC-200型PCR仪上进行。采用实验室长期使用的20 μl 反应体系,其成分为:10×Buffer(不含Mg2+)加0.8μl 25mM Mg2+,1 μl2.5 mM dNTPs,1UTaq DNA聚合酶,1 μl 0.4 μM10碱基随机引物,50 ng模板。反应程序:预变性94℃ 2 min;预扩增程序:94℃ 20 s,36℃ 30 s,72℃ 1 min,5个循环;扩增程序:94℃ 20 s,40℃ 30 s,72℃ 1 min,40个循环;然后72℃延伸10 min,最后4℃保存。扩增产物经含有0.5 μg/ml EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离(72v电压下电泳45 min),电泳结束后在UVP GDS-8000凝胶成像系统上观察照相,扩增产物长度与300 bp DNA ladder标记物比较。

  4结果与分析

    对10个筛选过的引物进行了扩增,结果引物S12(5'CCTTGACGCA3')扩增的结果稳定,如图1所示:宁夏中宁、新疆精河、内蒙杭锦后旗和河北巨鹿宁杞1号S331和S12扩增的DNA指纹图谱完全一致。而宁夏中宁宁杞1号的制品枸杞子与它们有差异,S12扩增的宁杞1号制品2 000 bp的主条带消失,1 500 bp的主条带一致,1 500 bp以下次条带的亮度发生了变化。

  5讨论

    从实验结果可知,同一品种不同产地宁夏枸杞叶片基因组DNA扩增出的指纹图谱完全相同,再次证明[4,6]DNA指纹图谱用于宁夏枸杞道地品种的鉴定结果可靠。

    制品枸杞子与其叶片的DNA 指纹图谱相比,在主条带方面主要是缺少较长碱基对的扩增条带,推测是由于果实在炮制过程或DNA提取过程中DNA发生部分降解造成的,而在弱条带方面亮度发生改变,从RAPD的原理[3]考虑,这可能是由于弱条带本身就不稳定,部分降解的DNA使整个RAPD反应体系发生了改变,从而不稳定扩增条带(弱条带)的亮度会发生改变,表现为有的条带亮度可能增强,有的条带亮度可能减弱。这表明如何从枸杞子中提取出未降解的基因组DNA还有待于进一步研究。

    有关用枸杞子作为材料进行RAPD研究[5,7~9]获得的绝大部分扩增条带较短(<1 000 bp),我们实验室的研究表明经过改进的CTAB法提取的叶片基因组DNA扩增出的条带长度大多数在500~3 000 bp之间 [4,6],暗示用枸杞子作为材料用RAPD技术对进行枸杞遗传多样性分析的可靠性值得注意。

    笔者通过自己的研究认为RAPD技术用于枸杞子的质量控制(宁夏枸杞道地品种的鉴定)从RAPD技术本身来看结果是可靠的,但要从枸杞子中提取出尽可能未降解的基因组DNA是我们面临的一个挑战。



【参考文献】
  [1]Williams J G, Kubelik A R, Livak K J, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic makers [J].Nucleic Acids Res,1990,25(18):6531.

  [2]Welsh J, Mcclelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J].Nucleic Acids Res,1990,25(18):7213.

  [3]邹喻苹,葛 颂,汪小全.系统与进化植物学中的分子标记[M].北京:科学出版社,2001:16.

  [4]严奉坤,许 兴,魏玉清,等.枸杞基因组DNA提取及指纹图谱分析[J].时珍国医国药, 2007,18 (1) :46.

  [5]Cheng KT, Chang HC, Huang H, et al. RAPD analysis of Lycium bararum medicine in Taiwan market[J].Bot Bull Acad Sin, 2000, 41:11.

  [6]魏玉清,许 兴,王 璞.宁夏不同地区主要栽培枸杞的RAPD分析[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2007,35(1) :91.

  [7]Zhang KYB, Leung HW, Yeung HW, et al. Differentiation of Lycium bararum from its related Lycium species using random amplified polymorphic DNA[J].Planta Med, 2001,67:379.

  [8]孙晓东,李 军,施京红.枸杞基因组DNA的提取与分析[J].陕西中医,2003,24(12) :1129.

  [9]李 军,郭晏海,秦雪梅.DNA随机扩增多态性在枸杞道地药材鉴别中的应用[J].中医药研究,2002,18 (3) :48.
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