正交实验法优选鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的提取工艺
【摘要】目的研究鱼腥草中胰蛋白酶抑制剂活性成分的最佳提取条件。方法以提取液对胰蛋白酶的抑制率为指标，采用正交试验法对提取温度(A)、溶剂用量(B)、pH值(C)、提取时间(D)4个因素进行优选研究，并以优选出的提取方案进行验证实验。结果因素B对提取效果有极显著的影响，因素A、C均有显著的影响，因素D影响不显著。结论鱼腥草中胰蛋白酶抑制活性成分有效部位的最佳提取工艺为A1B2C3D2。【关键词】鱼腥草 胰蛋白酶抑制剂 正交实验
Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction procedure for trypsin inhibitor from Houttuynia cordata Thunb.．MethodsThe inhibition rate of trypsin activity was used as screening parameter, we employed the orthogonal design method to test the effects of four factors, including temperature of extraction solution (A), volume of extraction solution (B), pH value of extraction solution(C) and time of extraction (D), on the extraction of trypsin inhibitor.ResultsFactor B performed the most significant effect on the extraction, and factors A and C came the next and factor D the last. ConclusionThe optimum extraction technology is A1B2C3D2 when the inhibition ratio of trypsin activity is considered as preferential parameter.
Key words:Houttuynia cordata Thunb.;Trypsin inhibitor;Orthogonal design
蛋白酶抑制剂（proteinase inhibitor, PI）是一类能够抑制蛋白水解酶活性的物质，广泛存在于动植物和微生物中［1］。其中胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor, TI）具有重要的药用价值,对急性胰腺炎、肺气肿、抗休克、防治脑水肿和脑缺血等都有很好的临床治疗效果，还有研究表明对 HIV 和肿瘤的治疗也有重要意义［2］。因此，从传统中药中筛选具有TI活性的材料有很广阔的应用前景和市场价值。
鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的地上部分，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋之功效，是临床应用极其广泛的中药之一［3］。本实验根据前期筛选的结果，利用鱼腥草为材料对从鱼腥草中提取TI的工艺进行优化，找出最佳的提取条件，为今后的工业化生产TI提供基础性数据。
1仪器与试剂
1.1试剂胰蛋白酶( 北京麒麟宏伟公司) 、大豆蛋白酶抑制剂（国药集团化学试剂有限公司）、苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPNA）（上海三杰生物技术有限公司）、三-羟甲基-氨基甲烷、无水氯化钙、盐酸、三氯乙酸、氢氧化钠等为国产分析纯；鱼腥草。
1.2仪器可见光分光光度计(7202B) 、离心机（LD-4） 、精密pH 计、水浴锅、精密电子天平（FA2004N）。
2方法
2.1鱼腥草中胰蛋白酶抑制活性成分提取的正交实验设计根据文献［4～6］及预实验结果，本实验采用双蒸水作为提取TI的溶剂。称取干燥的鱼腥草全草5 g，粉碎，在平行操作条件下，选用L9(34)正交实验表进行提取实验，以胰蛋白酶活性大小为指标，进行9次实验，每次实验重复3次（正交因素水平见表1），然后过滤并收集滤液，减压浓缩到100 ml。 表1因素水平（略）
2.2鱼腥草中胰蛋白酶抑制活性成分对胰蛋白酶的抑制率测定方法采用苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPNA）法［7］：取胰蛋白酶液1 ml，加药材提取液1 ml在37℃水浴保温5 min，加入BAPNA溶液5 ml，37℃水浴保温10 min后，立即加1 ml三氯乙酸（30%）终止反应，用分光光度法在410 nm条件下测定吸光度。按下列公式计算样品提取液的抑制百分率：i=(Ar-Abr )-(As-Abs)(Ar-Abr)×100%
式中：i —抑制百分率；Ar —标准溶液的吸光度；Abr—含标准溶液的空白对照液的吸光度；As—样品溶液的吸光度；Abs—含样品溶液的空白对照液的吸光度。3结果与方差分析
结果见表2，表3。由方差分析可知，各因素对提取效果的影响程度依次为B>A>C>D，其中因素B为高度显著，因素A，C影响显著，因素D没有统计学意义，对试验结果的影响很小。由R值可知, 各因素对试验结果的重要次序为B>C>A>D。考虑到规模化生产中经济、效率等因素,本文优选工艺A1B2C3D2, 即在60℃，用30倍量水, pH值为9，3 h/次为最佳提取工艺。按照此工艺条件进行3次平行实验，测定提取液对胰蛋白酶的抑制率，结果平均抑制率为58.27%，表明本实验确定的工艺路线稳定可靠。表2L9(34)正交实验结果（略）表3正交实验的方差分析（略）
4讨论
因素A对实验结果有显著的影响，60℃时提取活性最高，随着温度的上升抑制率有下降的趋势，说明随着温度的上升对TI有失活的作用。因素B对实验有高度显著的影响，在所有因素中影响最显著，说明随着溶剂量的增加会提高TI的提取效率，但从变化趋势看当30倍量时继续增加溶剂量，TI的提取率增幅不是很明显，因此考虑生产成本和效益用30倍量是最好的。因素C对实验结果也有显著影响，随着pH值的增加，提取活性成分的提取率增加，这说明在碱性条件下提取效率升高。
本实验通过正交实验法对提取工艺条件进行了优化, 并按最佳工艺进行了验证试验, 结果证明用该工艺作为鱼腥草中TI的有效部位的粗提取，具有工艺简单、提取率高、操作控制容易、稳定性好的特点。
【参考文献】
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