浅谈Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析

打盹的憨包子

      
　　摘要:目的 分析Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的结构。方法 用3对以土曲霉洛伐他汀合成酶基因为基础设计的PCR引物对红曲霉基因组进行了PCR分析，其中一对引物序列为，正向：5’TTC GAT GCG GCC TTC TTC AAT3’和反向5’ATG GTT CGG CAT CGT AAT TCC 3’ 。结果 在红曲霉基因组中相当于土曲霉洛伐他汀合成酶基因的LNKS区域扩增出了745 bp的核酸片段，其序列与土曲霉合成酶的这一区域序列相同。结论 土曲霉和红曲霉洛伐他汀合成酶基因存在同源区域。

　　关键词:红曲霉平;土曲霉;洛伐他汀合成酶合成酶CR

　　Abstract: Objective Analyses the structure of Monascus ruber 5031 lovastatin biosynthesis gene cluster. Methods Three pairs of degenerate PCR primers were designed matching the regions of lovastatin biosynthesis gene cluster in Aspergillus terreus,one of them is,5’primer: TTC GAT GCG GCC TTC TTC AAT,3’primer: ATG GTT CGG CAT CGT AAT TCC. Results A 745bp DNA sequence was amplified by PCR from Monascus ruber 5031 genomic DNA and the sequence is the same with Aspergillus terreus lovastatin biosynthesis gene. Conclusion There is similar sequence within the lovastatin biosynthesis gene cluster of Aspergillus terreus and Monascus Ruber.

　　Key words:Monascus ruber;Aspergillus terreus;lovastatin biosynthesis gene cluster; PCR

　　红曲霉(Monascus ruber )中产生的莫那可林K(monacolin K)即洛伐他汀(lovastatin)，是胆固醇生物合成中的关键酶HMGCoA还原酶的竞争性抑制剂，是目前治疗高血脂症最有效的药物之一，并且对心绞痛患者和心肌梗死患者也有一定的治疗效果[1]。此外，它还可下调炎症相关转录因子的表达,从而有益于治疗动脉粥样硬化症[2]。近期研究表明,它可促进恶性甲状腺细胞凋亡[3]，具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能[4]。

　　对参与洛伐他汀生物合成的聚酮合成酶的研究主要在土曲霉中进行[5-7]，土曲霉也是目前工业化生产洛伐他汀的主要菌种。Reeves和Vederas等研究了土曲霉(Aspergillus terreus)洛伐他汀的PKS基因结构，序列分析发现在克隆的64 kb DNA中有18个开放读框(ORF)，经序列对比分析确定了13个ORF的功能。其基因簇可分为洛伐他汀结构中九酮部分的合成酶基因(即LNKS)和二酮部分的合成酶基因(即LDKS)，LNKS也称为lovB，而LDKS含有的功能域有：lovC(烯酯酰还原酶)、lovD(转脂酶)、 ORF8(HMGCoA还原酶)、lovE(调节蛋白)、lovF(聚酮合成酶)、ORF13(调节蛋白)及细胞色素P450 加单氧酶等。

　　红曲霉中与合成洛伐他汀相关基因的结构的研究则较少，Chen等[8]于2005年8月发往Genebank的丛毛红曲霉的莫那可林K合成酶基因簇是第一个被发现的红曲霉合成洛伐他汀相关酶的基因簇。由于红曲霉中可产生洛伐他汀及多种有生理活性的物质，它又是传统的食品添加剂，所以通过分析研究红曲霉中洛伐他汀合成相关基因将有利于更好地开发利用红曲霉。本文分别以土曲霉的LNKS基因的KS区域(位于lovB基因区域内)、土曲LDKS基因簇中的 lovC(烯酯酰还原酶功能域)及lovE(调控蛋白功能域)基因为靶标设计了3对PCR引物，以这3组引物对产洛伐他汀的红色红曲霉菌的基因组DNA进行了PCR分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株和培养基

　　红曲菌种：中国工业微生物菌种保藏中心红色红曲霉Monascus ruber 5031。

　　斜面培养基：取50 g大米，洗净加水800 mL，煮成稀粥，冷却到60~65 ℃。将150 g麦芽粉掺入大米粥中搅拌均匀，放入55~60 ℃保温箱内糖化4 h，取出过滤。取250 mL加250 mL水，加2%的琼脂，装瓶、灭菌。

　　菌丝生长培养基：以上培养基不加琼脂。

　　1.1.2 仪器与试剂

　　日立高速冷冻离心机。Monacolin K 标准品，购自Sigma公司。PCR引物由上海生工合成。Taq酶采用上海生工的Taq Plus。上海生工的胶回收试剂盒UNIQ-10。TaKaRa公司的pMD-18T克隆载体。

　　1.2 方法

　　1.2.1 培养方法

　　用2 mL无菌水冲洗孢子，接入固体斜面培养。

　　固体斜面培养7 d后，以5 mL水洗下，稀释至浓度为107个/mL，取2 mL加入100 mL菌丝生长培养基，培养温度28 ℃，转速150 r/min。培养4 d。

　　1.2.2 红曲基因组DNA的提取

　　根据文献[9]的方法改进而成。取1 g菌丝，液氮中磨成粉状，加入5 mL 2×CTAB缓冲液[100 mmol/L trisCl (pH 8.0),20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl,2%(ρ)CTAB,2%(ρ)β巯基乙醇]，58 ℃ 1 h，冷至室温后加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)抽提，10 000 g离心10 min，取上清，加入0.1倍体积10% CTAB0.7 mol/L NaCl溶液，温和摇动，再加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)抽提，10 000 g离心10 min，取上清，加入2/3体积预冷异丙醇沉淀DNA，1 000 g离心15 min，沉淀溶于100 μL TE中，加入RnaseA至终质量浓度100 μg/mL，37 ℃作用2 h，加入等体积酚氯仿(1∶1)抽提，10 000 g离心10 min，上清中加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA，沉淀用70%乙醇洗1遍，风干，溶于TE，4 ℃保存。

　　1.2.3 PCR引物的设计

　　3对PCR引物的设计详见表1。表1 PCR引物的设计(略)

　　第1组引物是参照Thomas等[10]针对土曲霉的lovB基因的KS功能域序列设计的引物设计的。

　　1.2.4 PCR反应

　　①反应体系：200 μmol/L dNTPs,1 U Taq酶，2.625 mmol/L MgCl2,2 μmol/L MgSO4,10 mmol/L KCl,10 mmol/L (NH4)2SO4,20 mmol/L TrisHCl(pH 8.75),0.1% Tritonx100,0.1 mg/mL BSA,模板40 ng(基因组DNA和cDNA),引物60 ng，总反应体积20 μL。②热循环条件：94 ℃预变性5 min，之后以94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min程序45个循环，延伸72 ℃ 10 min。

　　1.2.5 lovB扩增片段的克隆与测序

　　回收及克隆红曲的lovB引物扩增产物中约750 bp的片段，其中连接反应液成分为pMD18T载体1 μL，PCR产物4.5 μL，含T4连接酶和连接酶缓冲液的solutionⅠ5 μL，在16 ℃连接2 h。大肠杆菌DH5α感受态的制备及转化均按分子克隆指南方法操作。克隆的片段交由TaRaKa公司完成测序。
2 结 果 1 以基因组DNA进行扩增反应的结果,见图1。

　　图1表明第1组引物对lovB的扩增得到了预期的产物(745 bp)，而第2组和第3组引物对lovC和lovE的扩增均未得到预计的产物。 2 lovB扩增片段测序结果

　　回收约745 bp的片段，并进行测序。经与土曲霉洛伐他汀合成酶基因对比，序列完全相同，序列如下，其中阴影部分是引物序列。

　　3 讨 论 1 lovB相关的第一组引物的设计及结果分析

　　第1组引物参考了Thomas等[10]针对土曲霉lovB(长度约11 kb)中KS功能域设计的引物，Thomas等在设计引物的过程中参考了土曲霉产生洛伐他汀酶基因序列及其他真菌的聚酮合成酶基因和真菌的脂肪酸合成酶基因，使其不易扩增出其他相似功能的基因。其原设计的引物为正向5’TTT CAT GCI GCI TTT TTT AA3’;反向5’ATG ATT IGG CAT ICT IAT TCC 3’。本文根据这两段引物及土曲霉lovB基因相关序列设计出第1组引物。从测序结果来看，表明本文中所用的红色红曲霉基因组中有与土曲霉lovB中相关序列一致的745 bp的序列，它很可能就是红色红曲霉中洛伐他汀合成酶基因簇中的一部分。 2 lovC相关的第2组引物的设计和lovE相关的第3组引物的设计

　　土曲霉洛伐他汀合成酶基因中的LDKS长度约为43 kb，含有lovC和lovE等功能域。

　　第2组和第3组引物是以primer 3程序根据土曲霉洛伐他汀合成酶基因lovC和lovE设计的引物，在设计过程中避开了内含子。但在本实验中未得到预期扩增片段，可见在红色红曲霉和土曲霉中的这2个基因差异较大。 3 3组引物与新发现的丛毛红曲霉的洛伐他汀合成酶基因簇[8]的电子PCR分析

　　从丛毛红曲霉中得到的洛伐他汀基因簇长度约45 kb，Genebank 序列号为DQ176595，含有mkAmkI等9个功能域，其中mkA和mkB是聚酮合成酶功能域，其他功能域与LDKS类似，但不含烯酯酰还原酶功能域。3组引物都未能从找到匹配序列，也即没有扩增产物。

　　洛伐他汀生物合成过程复杂，其合成酶基因簇庞大，不同红曲霉洛伐他汀合成酶基因有较大的差异，本文PCR扩增的片断可作为克隆Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的探针。

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