结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性

JZ041567

作者：薛莹　李元　史皆然　师长宏　李别虎　范雄林　柏银兰　马文煜


【关键词】  分枝杆菌
    关键词: 分枝杆菌;Ag85B蛋白;免疫学  
    摘 要:目的  研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性. 方法  用原核表达的Ag85B蛋白免疫BALB/c小鼠，ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞，体外用抗原再刺激，MTT方法检测IFN-γ产生水平和MTT法检测淋巴细胞增殖. 结果  Ag85B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答，免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激，淋巴细胞的增殖较显著.MTT方法检测Ag85B免疫小鼠的IFN-γ量为960pg・L-1 ，而生理盐水对照组的量低于80pg・L-1 . 结论  Ag85B有可能作为新型结核疫苗的组分.
      
　　Keywords:mycobacterium;Ag85B;immunobiology
      
　　Abstract:AIM To investigate the immunobiological proper-ties of secretory protein Ag85B of MTB H37Ra.METHODS BALB/c mice were immunized with Ag85B.ELISA was used to detect the anti-Ag85B antibody titer in the immunized　mice sera.Level of IFN-γsecreted from splenocytes of the immunized mice after specific-antigen stimulation was detect-ed by using a cytopathic effect reduction assay and splenocytic proliferation of the immunized mice in response to antigen restimulation was detected by MTT method.RESULTS Ag85B-immunized mice induced higher anti-Ag85B antibody titer，and protective cellular-mediated immunity was charac-terized by splenocytes which upon antigen-specfic stimulation secreted increased levels of IFN-γand proliferated significant┐ly.CONCLUSION Ag85B can be used as a novel component of the new TB vaccine.
      
　　0 引言
      
　　结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一.近年来，由于卡介苗（BCG）保护性的不完善，结核菌耐药菌的产生，爱滋病的流行，世界人口的剧增，全球性旅游业的发展以及吸毒、酗酒、贫穷等原因，结核病呈日益严重的回升趋势，再次成为危害人类健康的世界性疾病［1］ .因而，积极研究结核病的致病及免疫机制，研制更为有效的预防、诊断和治疗结核病的新技术、新方法已成为迫在眉睫的事情.为此，我们在原核表达载体中表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因并对其免疫学特性进行初步研究，以期为结核病新型疫苗的研制奠定基础.
      
　　1 材料和方法
      
　　1.1 材料  pPRO-EXHT-TB30为编码Ag85B蛋白基因的原核表达质粒（作者构建）［2，3］ ，E.coli DH5α，L929细胞、VSV由本室保存，MTB H37Ra由陕西省结核病防治研究所惠赠，RPMI1640及MTT购自Sigma公司，IFN-γ标准品购自晶美公司（Pe-proTechEc产品，England），大肠杆菌重组表达的Ag85B标准品及其特异性单抗由加州大学Harth G博士惠赠，BALB/c雄性小鼠20只6～8wk龄，由第四军医大学实验动物中心提供.  
　　1.2 方法
      
　　1.2.1 结核分枝杆菌分泌蛋白的表达  将pPRO-EXHT-TB30转化E.coli DH5α，IPTG诱导4h，表达目的蛋白［2］ .
      
　　1.2.2 动物免疫  BALB/c小鼠随机分3组.Ag85B及BCG免疫组各7只，生理盐水阴性对照组6只，Ag85B组小鼠初次免疫采用皮下包埋的方法:Ag85B表达菌经裂解后，先进行SDS-PAGE，再行Western-blot，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，丽春红染色确定表达蛋白带后，将印有表达蛋白条带的硝酸纤维素膜剪下包埋于小鼠腹股沟皮下.后2次免疫用剪下的SDS-PAGE凝胶上的表达蛋白条带，匀浆后，5000r・min-1 离心5min，取上清（简称匀浆上清），于小鼠后大腿每侧各肌肉注射50μL，同时设BCG免疫组和生理盐水阴性对照组.
      
　　1.2.3 血清抗Ag85B抗体的测定  免疫完成后第2周剪尾取血，分离血清，1∶20稀释后，ELISA方法测定血清中抗Ag85B抗体的滴度，每孔用Ag85B标准品（5mg・L-1 ）包被酶标板，4℃过夜，10g・L-1 BSA37℃封闭30min，洗涤后加不同稀释度的待测血清，二抗为羊抗鼠IgG-HRP OPD产物显色后，测A490nm 光吸收值，以正常鼠血清作阴性对照，P/N≥2.1为阳性.
      
　　1.2.4 抗原特异的脾淋巴细胞增殖实验  分别分离各组小鼠的脾淋巴细胞，调整细胞数为5×108 ・L-1 ，每孔200μL，在96孔板用含100mL・L-1 FCS的RPM11640完全培养液中培养，同时每孔加入匀浆上清50μL为实验组，对照组不加匀浆上清，调零孔不加脾细胞，37℃50mL・L-1 CO2 孵箱培养68h后，每孔加入20μL MTT（5g・L-1 ，溶于PBS，pH7.2）继续培养4h后终止培养，去尽上清，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，测A490nm 值，结果用刺激指数（stimulation index，SI）=实验组A值/对照组A值.
      
　　1.2.5 IFN-γ的诱生和测定［4］5×109 ・L-1 脾细胞在96孔板用含100mL・L-1 FCS的RPMI1640完全培养液培养，每孔200μL，同时每孔加入匀浆上清50μL，37℃50mL・L-1 CO2 孵箱培养72h后，每组3个孔中的培养液混合，5000r・min-1 离心5min，取上清于-20℃冻存备检.MTT法检测IFN-γ含量.L929细胞用含50mL・L-1 FCS的RPMI1640完全培养液在96孔板培养，每孔约3×104 个细胞，各加不同稀释度的待检样品和IFN-γ标准品，37℃50mL・L-1 CO2 孵箱培养24h，再加50μL100TCID50 VSV攻击20h，每孔加入20μL MTT，继续培养4h后终止培养，同上检测A490nm 值，以标准IFN-γ为准根据直线作图法计算待测IFN-γ含量（1U相当于100pg）. 统计学处理:数据采用x ±s表示.采用t检验进行组间处理，P<0.05为差异有显著性.
      
　　2 结果
      
　　2.1 原核细胞表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B及其产物的鉴定  表达菌经诱导后，进行120g・L-1 SDS-PAGE，发现约在Mr 为31000处有一条蛋白带，同预计的大小相吻合（Fig1）.将其与抗Ag85B特异性mAb做免疫印迹，发现在Mr 约为31000处表达有一条带，表明此表达产物含有能与抗Ag85B的特异性mAb相结合的表位.
    图1 略
      
　　2.2 血清抗Ag85B抗体的水平  用ELISA的方法对免疫后的各组小鼠血清中Ag85B抗体的水平进行了测定，生理盐水对照组的鼠血清Ag85B抗体为阴性.Ag85B免疫和BCG免疫组鼠血清Ag85B抗体滴度分别为1∶160和1∶80.
      
　　2.3 脾淋巴细胞增殖实验  Ag85B免疫小鼠及BCG免疫小鼠的淋巴细胞在体外用匀浆上清刺激，可引起淋巴细胞显著的增殖反应.而生理盐水对照组的小鼠脾淋巴细胞的增殖不显著（Fig2）.
           
　　图2 略
　　2.4 IFN┐γ的水平  Ag85B免疫小鼠及BCG免疫小鼠的脾淋巴细胞用匀浆上清刺激，悬液中IFN-γ的水平用MTT方法检测，Ag85B免疫小鼠及BCG免疫小鼠IFN-γ的均数分别为（960±36）pg・L-1 和（814±48）pg・L-1 .而生理盐水对照组低于80pg・L-1 .实验组与对照组相比，差异非常显著（P<0.001）.
  　3 讨论
      
　　Verbon等［5］ 和Wiker等［6］ 研究发现，结核杆菌在对数生长早期可分泌释放一组蛋白，且这类分泌蛋白是目前所确认的结核杆菌蛋白中唯一能诱发保护性免疫的一类蛋白，因此，机体的保护性免疫很可能与结核杆菌的分泌蛋白有关.目前报道的不同相对分子质量的分泌蛋白较多，约有十几种，其中较有可能具有保护性的蛋白Mr 为16，23.5，30和70×103［7］ .1996年，美国的Huygen等［8］ 首次报道用结核分枝杆菌Ag85编码基因的质粒DNA免疫鼠，可诱导小鼠产生很强的细胞和体液免疫反应，抵御结核分枝杆菌和BCG的攻击.
     
　　Ag85复合物是结核分枝杆菌、牛分支结核杆菌（N.bovis）及BCG短期培养液中的主要分泌蛋白，是一种热不稳定性蛋白.对流免疫电泳可将此蛋白分为Ag85A，Ag85B和Ag85C3组分，Mr 分别为31×10 ，30×103 和31.5×103 的蛋白质.Sinha等［9-11］ 比较了6种不同的结核分枝杆菌培养液中分泌蛋白的免疫学特性发现，在小鼠体内，Ag85B蛋白能诱导实验动物产生Th1型细胞免疫应答，其抗分枝杆菌再感染的能力优于BCG.Lozes等［12，13］ 给小鼠肌肉注射编码Ag85复合体的DNA质粒疫苗发现，注射编码Ag85A和Ag85B DNA质粒疫苗的免疫小鼠对天然Ag85复合体的刺激可引起Th1样反应，即引起IL-2和TNF-α的升高，而IL-4，IL-6及IL-10水平较低或没测到.编码Ag85C的DNA质粒疫苗却没作用.近年研究发现，分枝杆菌毒株短期培养液中的3种分泌蛋白（Ag85B，ESAT-6，MPT64）免疫动物后均可引起明显的T细胞增殖和IFN-γ释放，因而都可作为新型疫苗的组分，或作为亚单位疫苗［14］ .
     
　　本试验采用皮下包埋原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的方法免疫小鼠后，在小鼠血清中可检测到较高水平的Ag85B抗体，说明此种免疫方法有效可行.机体抗结核的保护性免疫主要依赖于Th1型的细胞免疫应答，我们的研究也表明Ag85B蛋白免疫小鼠也可产生较高水平的IFN-γ和以脾淋巴细胞明显增殖为特征的细胞免疫反应，这都说明 Ag85B蛋白有可能作为新型抗结核的亚单位疫苗和基因疫苗的组分.我们还要进一步研究Ag85B蛋白和其他一些有保护性的蛋白联合使用后的细胞免疫效果，为新型疫苗的研制奠定基础.  
　　参考文献:
      
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