内皮抑素和血管抑素抑制类风湿关节炎血管发生的研究进展

JZ041567

【摘要】血管发生在类风湿关节炎的病理过程中起着重要的作用。内皮抑素(ES)和血管抑素(AG)是内源性血管发生抑制剂，能特异地抑制血管内皮细胞的增殖和迁移、并诱导内皮细胞凋亡，从而发挥抗血管发生的作用。本文就它们的结构、作用机制以及对RA血管发生的影响进行综述。
【关键词】血管发生；类风湿关节炎；内皮抑素；血管抑素
        类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)病理变化为持续性滑膜炎及血管翳形成，尤其依赖于广泛的新生血管网的形成。血管翳具有类似于肿瘤组织的特性，它可侵蚀关节软骨和骨组织，最终导致关节功能丧失。临床研究证实类风湿性关节炎关节内新生血管增生的程度与患者的病情及滑膜增生的程度呈正比。有学者认为，在类风湿性关节炎的发病过程中，血管发生出现得很早，甚至在炎症特异的临床征象和组织学征象出现以前就有了。动物实验证明如果有效地抑制血管翳新生血管生成，则可缓解实验性关节炎，这为临床防治类风湿性关节炎提供了新思路。2002年日本Tomohisa Sekimoto博士就首先提出了直接抑制血管生成可以治疗类风湿关节炎的观点。Douglas[1]等也认为抑制血管生成是类风湿关节炎的一个潜在的治疗靶点。血管生成抑素和内皮细胞抑素是大分子蛋白前体的酶解片段，也是目前研究得较多的内源性血管生成抑制因子，对类风湿关节炎血管发生具有重要意义。
        1RA血管发生
        血管发生是造成滑膜炎、血管翳、骨和软骨破坏的主要原因。血管发生(angiogenesis)是指在原有血管基础上，通过“分支”或“萌芽”形成新的以毛细血管为主的血管系统的过程。血管发生是一个由促血管生成和抑制血管生成因子共同调控的复杂过程[2]。促血管生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管生成素(angiogenin)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、间质金属蛋白酶(MMP)、血管生成素-1(Ang-1)、白细胞介素-8(IL-8)等；而抑制血管生成因子包括γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-12(IL-12)、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、血小板第4因子(PF-4)、内皮抑素(endostatin)、血管抑素(angiostatin)等，其中以内皮抑素、血管抑素功能最强[3]。
        2内皮抑素(endostatin，ES)
        2.1ES来源和结构:ES是1997年美国哈佛大学O’ Reilly等[4]从鼠血管内皮细胞瘤(EOMA)中分离和提纯出来的一种多肽，分子量为20 kD，经氨基酸序列分析提示，ES为ⅩⅧ型胶原C-末端非胶原区(NC)的184个氨基酸片断(132AA-315AA)。在ES的序列中还存在由N端1、3、11三个组氨酸残基和76位的天门冬氨酸残基构成的锌离子结合位点，可能与其种族特异性有关。在ES表面有一个由11个精氨酸残基组成的区域，被认为是ES与肝素高亲和结合的位点，通过这一位点对抗促血管生成因子与肝素的结合，从而抑制血管的生成。
        2.2ES对RA血管发生的影响:血管发生是类风湿关节炎的重要病理过程，也是造成关节破坏的主要原因，抑制关节内的血管发生有可能成为治疗RA的潜在靶点。ES是目前发现活性的最强的内源性抗血管生成因子[5-6]，对血管发生具有明显的抑制作用，其主要机制在于它通过特异性作用于新生血管的内皮细胞,并抑制VEGF等血管生长因子，从而抑制内皮细胞的增殖与迁移，同时诱导其凋亡，发挥抗血管生成作用。周润华等[5]将ES研磨成粉处理佐剂性关节炎大鼠模型，以小剂量ES治疗组终浓为2.5mg/(kg·d)，大剂量ES治疗组终浓度为10 mg/(kg·d)的剂量，分别加入2-4 mL生理盐水灌服。他们发现小剂量和大剂量ES治疗组大鼠关节滑膜均无明显肿胀等炎症表现，模型对照组关节滑膜增厚的炎症现象明显。与模型对照组相比，正常对照组、小剂量及大剂量ES治疗组血管内皮细胞生长因子(VEDF)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达均降低，且下降幅度与ES的浓度呈正相关。此研究结果说明ES可以通过下调VEDF表达、抑制MMP活性来抑制血管发生。夏丽娟等[7]对佐剂性关节炎大鼠皮下注射给予不同剂量的重组人ES( 1.25、2.5、5mg/kg)，连续7d，对照组于10天给予氨甲喋呤(Methotrexate，MTX，1.0 mg/kg)。重组人ES各剂量组能明显抑制AA大鼠的继发性足肿胀，重组人ES各剂量组可不同程度减少AA大鼠关节滑膜组织高表达的VEGF，还可使滑膜组织的微血管密度减少。重组人ES可显著抑制AA大鼠滑膜组织VEGF的表达及微血管密度，该作用可能与抑制血管翳的生成及减少滑膜细胞表面VEGF的表达有关。由此可见，ES在RA血管发生过程中具有重要意义。
        2.3ES抑制RA血管发生机制:ES可以通过抑制血管内皮细胞增殖、促进其凋亡、抑制内皮细胞迁移等方面而抑制血管发生[8-9]。
        2.3.1抑制血管内皮细胞增殖:ES与VEGF的受体KDR相互作用，阻断VEGF的信号转导。大量研究表明，VEGF是诱导新生血管形成的重要因子，它通过内皮细胞表达的两个主要受体-酪氨酸激酶KDR/Flk和Flt-1及其下游信号分子诱导内皮细胞有丝分裂和迁移。ES可与VEGF受体KDR/Flk-1直接相互作用，下调KDR/Flk-1表达，使VEGF与其受体结合减少，抑制VEGF介导ERK、p38MAPK和p125FAK酪氨酸磷酸化，从而抑制VEGF诱导的新血管形成[10]。杨荻等[11]向培养的血管内皮细胞中加入VEGF刺激其生长，然后加入ES (157、313、625、1250、2500、5000和10000mg/L)作用后对内皮细胞增殖作用进行观察。他们发现，不同浓度的ES对内皮细胞均有明显抑制作用，并呈浓度依赖性。
        ES使内皮细胞周期停滞在G0/G1期，并减少进入S期细胞的数量[12-13]。细胞周期素D1和β-连环蛋白是ES作用于内皮细胞周期的靶点，ES下调β-连环蛋白的转录活性，使β-连环蛋白诱导编码细胞周期素D1作用降低，并通过减少Rb基因产物磷酸化，下调细胞周期素D1 mRNA和蛋白表达，引起内皮细胞周期G1期阻滞，从而减少了进入S期细胞的数量。
        2.3.2促进内皮细胞凋亡hanabal等[12]用溶源性酵母的小鼠ES使内皮细胞发生了具有凋亡特征的形态学改变(如染色质凝集、染色体碎裂)。其可能的机制为：一、增加了内皮细胞内蛋白酶-3的活性，使细胞核内DNA发生降解。二、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表达。三、与原肌凝蛋白发生作用，破坏微丝的完整性而抑制内皮细胞运动。
        2.3.3抑制内皮细胞迁移:内皮细胞的迁移的重要条件是血管基底膜被破坏，基质金属蛋白酶(MMP)在破坏基底膜中起着重要的作用。ES可抑制MMP-2的激活和催化活性，减少细胞外基质蛋白水解，从而抑制内皮细胞的迁移[14]。此外，ES作用于内皮细胞表面上的整合素α5β1和跨膜锚定蛋白Caveolin-1，启动细胞内依赖酪氨酸磷酸化的信号传导，导致Caveolin-1相关的Src家族酪氨酸激酶的激活和肌动蛋白张力纤维的减少，破坏细胞间的粘附作用而抑制内皮细胞迁移[9, 15]。
        3血管抑素(angiostatin, AG)
        3.1AG的来源和结构:AG也是较早发现的内源性血管生成抑制因子之一，最初在lewis肺癌小鼠的血清和尿液中分离获得。它是纤溶酶原的蛋白酶解产物，大小约为38kD，可以经过酶降解纤维蛋白溶酶原得到AG。其后的研究发现由于酶解部位的不同，AG含有纤维蛋白溶酶原前1-4 kringle片段或者前1-3 kringle片段。kringle片段1-3和kringle片段1-4都叫AG，都有显著的抑制内皮细胞增生的作用。1996年Cao等[16]对人Angiostatin的前4个Kringles片段进行了系统研究，发现前1-3 Kringles片段抑制内皮细胞增殖的能力最强。AG通过内皮细胞表面的受体发挥作用，现已发现的血管抑素受体包括ATP合成酶的α/β亚基、整联蛋白α5β3。AG与ATP合成酶的结合会抑制ATP合成酶的活性，继而抑制内皮细胞的存活、增殖和迁移。AG与整联蛋白的结合则会影响内皮细胞与胞外基质的相互作用，抑制内皮细胞的迁移，并影响其存活。血管抑素特异作用于内皮细胞，体内和体外实验的研究表明，AG可以抑制内皮细胞的增殖和迁移，并诱导内皮细胞凋亡[17-18]。  
        3.2AG对RA血管发生的影响:和ES一样，AG也是一种强有力的内源性血管抑制因子。周玉秀等[19]的研究表明k1-5能有效治疗胶原诱导的鼠关节炎，可能是通过减少滑膜炎症侵润，进而减少了滑膜的血管形成。姚中强[20]的研究表明，AG治疗可以显著减低CIA滑膜血管密度，表明AG具有抑制RA血管发生作用。
    3.3AG抑制RA血管发生机制  
        3.3.1诱导内皮细胞凋亡:高大宽等[21]以加入重组人AGKringle (123) (AK(123))蛋白(300 nmol/L)的含100mL/L小牛血清DMEM培养基培养人脐静脉内皮细胞ECV304，72h后，采用透射电镜、流式细胞术细胞周期分析和核DNA琼脂糖凝胶(15 g/L)电泳检测重组AK(123)蛋白作用后血管内皮细胞的凋亡情况。他们发现，实验组ECV 304细胞检测到了典型的凋亡：透射电镜下可见细胞核染色质浓缩、边集、核碎裂及胞质浓缩等凋亡细胞典型的形态学改变；流式细胞术周期分析显示在G1期峰前存在一个凋亡峰(20.6%)等，而对照组ECV 304细胞表现正常。因此重组人AK(123)蛋白诱导了血管内皮细胞的凋亡，从而抑制血管内皮细胞的增殖。
        3.3.2抑制内皮细胞增殖和迁移ettin等[22]将人类真皮毛细血管内皮细胞培养于0.1%小牛血清培养基中来研究AG对内皮细胞迁移的影响。他们合成了K4-A、K4-B、K4-C、K4-AB四种肽链，分别加入含有0.1%小牛血清养基中做成实验组，对照组不做任何处理。培养内皮细胞16小时后，将其悬浮于含有0.1%小牛血清的DME中(含有VEGF作为化学诱导剂引诱内皮细胞的迁移)，覆盖在改良的博伊登室(进行趋化性实验的装置)的底面，让其粘附在37摄氏度的倒置房腔里2h。再次倒置房腔，内皮细胞粘附在房腔的上部，让其在37摄氏度下迁移4h。结果发现，所有的合成肽都能够抑制VEGF诱导的内皮细胞迁移，并且呈剂量依赖性。Dettin的血管抑素对内皮细胞的体外实验证明了它能够抑制内皮细胞的迁移，而发挥抗血管生成的作用。为研究血管抑素抑制血管内皮细胞生长的活性，高大宽等[21]利用脂质体法将带有大鼠血清白蛋白分泌信号的人AK(123)基因导入大鼠C6 胶质瘤细胞，结果表明，成功转染AK(123)基因的大鼠C6胶质瘤细胞可稳定表达AK(123)蛋白，且具有抗血管内皮细胞增殖活性的良好作用。
        4展望
        类风湿关节炎作为一种致残性自身免疫性疾病，严重影响患者的生活质量。血管发生在RA病变早期就出现，且同RA病变的严重程度相关。AG和ES能特异性抑制血管内皮细胞增殖、促进其凋亡和抑制内皮细胞迁移。因此，AG和ES可能在RA血管发生过程具有重要意义。然而对其在RA中研究还较少，只停留在动物实验研究阶段，且对其在RA患者中的表达和(或)表达改变机制及影响RA血管发生的机制均不明了，还有待于今后的进一步研究。
参考文献
[1]Douglas J. Inhibition of angiogenic pathways in rheumatoid arthritis: potential for therapeutic targeting [J]. Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 2006; 20(5):941-947
[2]Paleolog E. Angiogenesis in rheumatoid arthritis [J].Arthritis Res, 2002; 4(3):81-90
[3]Koch AE, Distler O. Vasculopathy and disordered angiogenesis in selected rheumatic diseases: rheumatoid arthritis and systemic sclerosis [J]. Arthritis Res Ther, 2007, 9(2):S3
[4]O Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth [J]. Cell, 1997; 88:277-285
[5]周润华, 莫汉有, 朱姗姗, 等．内皮抑素与佐剂性关节炎大鼠血管内皮细胞生长因子、基质金属蛋白酶-3及基质金属蛋白酶-9的表达[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2008, 12(24): 4628-4632
[6]黄学应, 陈飞虎, 张晓明, 等．重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞周期和PCNA表达的影响[J]. 中国药理学通报, 2009, 25(5):649-653
[7]夏丽娟, 陈飞虎, 黄学应, 等．重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织血管内皮细胞生长因子表达的影响[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2006, 11(7):760-763
[8]Hanai J, Dhanabal M, Karumanchi S, et al. Endostatin causes G1 arrest of endothelial cells through inhibition of cyclin D1 [J]. J Biol Chem, 2002, 277(19):16464-16469
[9]黄学应，陈飞虎，张晓明, 等．内抑素抗血管生成及抗类风湿性关节炎治疗[J].中国药理学通报, 2009,25(3):287-289
[10]Kim YM, Hwang S, Kim YM, et al. Endostatin blocks vascular endothelial growth factor- mediated signaling via direct interaction with KDR/Flk-1[J]. J Biol Chem, 2002, 277(31):27872-27879(下转第126页）
(上接第124页)
[11]杨荻, 张美霞, 张军军, 等． 内皮抑素对培养的血管内皮细胞增殖的影响[J]. 国际眼科杂志, 2008, 8(12):2411-2413
[12]Dhanabal M, Ramchandran R, Waterman MJ, et al. Endostatin induces endothelial cell apoptosis [J]. J Biol Chem, 1999; 274:11721-11726
[13]Dhanabal M, Ramchandarn R, Volk R, et al. Endostatin:yeast production, mutants, and antitumor effect in renal cell carcinoma [J]. Cancer Res, 1999; 59:189-197
[14]Lee S J, Jang JW, Kim YM, et al. Endostatin binds to the catalytic domain of matrix metallo- proteinase -2 [J]. FEBS Lett, 2002, 519(123):147-152
[15]MacDonald NJ, Shivers WY, Narum DL, et al. Endostatin binds tropomyosin. A potential modulator of the antitumor activtity of endostatin [J]. J Biol Chem, 2001, 276(27):25190-25196
[16]Cao Y, R-WJi, Davidson DJ, et al. Kringle domains of human angiostatin: Aharacterization of the anti2proliferative activity on endothelial cells [J]. J Biol Chem, 1996, 271:29461-29467
[17]吴江雪，徐本玲，黄文林．血管生成抑制因子的研究进展[J]. 癌症, 2005, 24(3):376-384
[18]O’reilly MS, Holmgren L, Shing Y, et al. angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastase by a lewis lung carcinoma[J]. cell, 1994, 79(2):315- 328
[19]周玉秀, 刘恩令. 血管抑素k1-5转基因治疗Ⅱ型胶原蛋白诱导的鼠关节炎[J]. 天津医药, 2006, 34(9):642-644
[20]姚中强. 血管内皮生长因子受体在胶原性关节炎动物模型中的表达及内皮抑素和血管抑素对其表达的干预[D]. 北京: 中国协和医科大学内科学，2003
[21]高大宽, 章翔, 吴景文, 等. C6细胞表达的人Angiostatin Kringle(123)体外抑制血管内皮细胞生长的研究[J]. 解放军医学杂志, 2000, 25(2):83-86
[22]Dettin M, Bicciato S, Scarinci C, et al. Synthetic peptides derived from the angiostatin K4 domain inhibit endothelial cell migration [J]. Chem biochem. 2003, 4(11):1238-1242