抑癌基因P33ING1在人皮肤血管瘤组织中的表达及统计分析

jz066520 · 发表于 2014-6-1 13:12:06

【摘要】目的：探讨抑癌基因P33ING1在人皮肤血管瘤组织中的表达及在血管瘤发生、发展过程中的意义。方法：应用免疫组织化学方法检测了血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤组织中抑癌基因P33ING1的表达水平, 采用HPIAS1000图文报告管理系统对P33ING1的表达进行定量分析，并用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果：P33ING1在增生期血管瘤内皮细胞呈低表达,退化期呈高表达，增生期血管瘤内皮细胞与退化期比较, P33ING1的表达差异有显著性(P<0.05);退化期血管瘤内皮细胞P33ING1表达水平与正常组织相比，差异无显著性(P>0.01)。结论：P33ING1作为抑癌基因,通过抑制内皮细胞凋亡而促进血管瘤的增生。P33ING1在血管瘤的发生发展中起了重要作用。

【关键词】皮肤血管瘤; P33ING1; 免疫组织化学; 统计分析

血管瘤是婴幼儿较常见的一种良性血管肿瘤，大多数血管瘤都有一个由增生到消退的自然病理演变过程[1～3]，但至今其病理演变机制仍不完全清楚，因此给血管瘤的诊断和治疗带来许多困难。细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程。血管瘤自发消退的过程中无炎症反应，无组织坏死，非常符合凋亡的过程，因此许多研究者推测可能是由于增殖的血管内皮细胞凋亡导致血管瘤自发消退。

　　P33ING1(Ihnibitorofgorwth)是一新的与P53密切相关的凋亡相关因子，有细胞生长抑制作用及促进细胞凋亡的作用[4，5]。抑癌基因对于肿瘤的发生具有抑制作用,细胞内一种或多种抑癌基因的失活可以导致肿瘤的发生。

　　本研究通过应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤织中P33ING1的表达水平，探讨P33ING1在血管瘤发生、发展过程中的作用机制，为临床上治疗血管瘤提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 材料来源收集武汉大学人民医院病理科及武汉大学人民整形外科2000～2007年皮肤血管瘤存档蜡块50例，其中男性26例，女性24例。所有切片经病理学专家诊断为血管瘤。这些血管瘤所在的部位有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性治疗。

　　1.1.2 材料分组常规HE染色和免疫组织化学SP法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，按Mulliken分类标准并结合PCNA的表达进行分组：增生期血管瘤27例，退化期血管瘤23例，另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作对照。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　1.2.1 主要试剂

　　①即用型鼠抗人PCNA单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);②即用型鼠抗人P33ING1单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);③超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);④DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.2.2 主要仪器

　　① YWY781型医用微波仪，250 W，50 Hz (浙江临安电子器材厂生产);② 家用高压锅;③电热恒温干燥箱 (湖北黄石医疗器械厂生产);④ 显微镜成像系统 (Olympus公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 HE染色蜡块切片厚5 μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规HE染色。

　　1.3.2 免疫组织化学SP法检测P33ING1和PCNA相关抗原

　　具体步骤如下：

　　① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;

　　③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　④ 正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;

　　⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;

　　⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应;

　　⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;

　　⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;

　　用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为阳性对照组，人正常皮肤表皮作为PCNA的阳性对照组。

　　1.3.3 免疫组织化学结果判断

　　P33ING1阳性染色为棕黄色颗粒，主要定位于细胞核内，胞质内也有少量染色。PCNA以细胞核出现出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

　　采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对P33ING1的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ,测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。

　　1.4 统计学处理

　　数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5 软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。

　　2 结果

　　2.1 HE染色

　　正常皮肤组织中的毛细血管由1到2个内皮细胞围成，管壁较薄，内皮细胞胞质薄，仅含核的部分略厚，内皮细胞核扁平。增生期血管瘤组织中可见条索状或片状内皮细胞增生,其间有不规则的内皮间隙和完整的血管腔,内皮细胞核肥大而淡染。退化期血管瘤组织中内皮细胞减少,血管腔增大,血管间结缔组织增多,内皮细胞核扁平。

　　2.2 PCNA 的表达

　　增生期血管瘤内皮细胞核肥大,核内弥漫分布棕黄色颗粒, PCNA表达强;退化期血管瘤内皮细胞核扁平,少数胞核内有少量棕黄色颗粒,PCNA弱表达。

　　2.3 P33ING1的表达

　　增生期血管瘤内皮细胞胞浆内可见少量棕黄色颗粒，P33ING1呈阴性表达;退化期血管瘤内皮细胞胞浆棕黄色颗粒沉积，P33ING1呈阳性表达;正常皮肤组织血管内皮细胞胞浆内可见一些棕黄色颗粒沉积，P33ING1表达呈弱阳性。图像分析结果显示: 增生期组P33ING1表达的平均光密度为0.0627±0.0118, 退化期组P33ING1表达的平均光密度为0.2540±0.0162,正常皮肤组P33ING1表达的平均光密度为0.2001±0.0130; 增生期组P33ING1表达的阳性面积率为0.0703±0.0114, 退化期组P33ING1表达的阳性面积率为0.2132±0.0169, 正常皮肤组P33ING1表达的阳性面积率为0.1988±0.0154,经单因素分析增生期组与退化期组比较(P<0.05)，差异有显著性。退化期组与正常皮肤组比较(P>0.01)，差异无显著性。正常皮肤组与增生期组比较，(P<0.05)，差异有显著性。见表。表1 血管瘤不同时期P33ING1表达的平均光密度和阳性面积率(注：增生期组与退化期组比较，* P<0.05; 退化期组与正常皮肤组比较，△P>0.01; 正常皮肤组与增生期组比较，# P<0.05。

　　3 讨论

　　皮肤血管瘤(hemangioma)是婴幼儿较常见的一种良性血管肿瘤，也见于成人。虽然部分个体皮肤的血管瘤可以自行消退，但生长部位特殊以及部分未自行消退的血管瘤具有一定的危险性。如：持续发展的血管瘤可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症;而位于颜面部、颅内及口腔的血管瘤可引起明显的外观畸形及功能障碍;大面积及多发性血管瘤由于占据大量血流可导致高输出性心力衰竭，直接威胁患者的生命[6，7]。皮肤血管瘤好发于头、面颈，次为四肢和躯干。发生率在新生儿为1.1%～2.6%，约有40%在出生时即可见到，时常在生后2～4周时快速生长。因此对这一部分血管瘤采取何种治疗手段是目前临床及基础研究较为关注的课题。

　　P33ING1是近年来研究发现的一种新的肿瘤抑制因子,其蛋白产物具有负调控细胞增长及诱导凋亡等生物学功能[8～10]。ING1基因位于13q3334,cDNA全长2061bp,开放阅读框架在第16898 bp,编码一相对分子质量为33350的蛋白,称之为p33。免疫荧光显示p33蛋白位于细胞核内[11～13]。目前的研究结果显示,p33ING1是一种细胞生长的负性调控因子,与细胞的生长、衰老、锚着依赖性和凋亡等生理过程有关,并且很可能是p53的一个伙伴基因[14～16]。　本实验采用免疫组织化学方法对50例人皮肤血管瘤组织PCNA的表达进行了检测,并结合PCNA的表达对血管瘤进行分期。

　　本实验结果显示：增生期组与退化期组比较(P<0.05)，差异有显著性。退化期组与正常皮肤组比较(P>0.01)，差异无显著性。正常皮肤组与增生期组比较，(P<0.05)，差异有显著性。p33工NGI在退化期血管瘤内皮细胞的表达明显高于增生期血管瘤内皮细胞和正常皮肤组织血管内皮细胞(P<0.05)，p33工NGI过表达可增加细胞对凋亡的敏感性，下降表达则阻止凋亡，增生期血管瘤凋亡的细胞少于退化期血管瘤及正常皮肤组织，这证实了p33ING1基因表达的减少使增生期血管瘤细胞凋亡不足，所以血管瘤内皮细胞不断增殖。在正常皮肤组织内，凋亡和抗凋亡系统相互作用，相互制约，共同维护细胞生理的动态平衡， p33工NGI在增生期血管瘤中的低表达抑制了凋亡效应子，使其发挥凋亡效应受挫，导致血管瘤的形成。因此我们推测

33ING1作为抑癌基因,通过抑制内皮细胞凋亡而促进血管瘤的增生。P33ING1在血管瘤的发生发展中起了重要作用。

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