人参皂苷Rg1对抗脑缺血再灌注大鼠脑组织pJNK蛋白表达的定量分析

jz066520 · 发表于 2014-6-1 13:12:32

   作者：刘霞　包翠芬　魏嘉　梁佳秦书俭

【摘要】  目的：探讨人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注大鼠脑组织pJNK表达的影响。方法：取健康雄性SD大鼠30只,将其随机分为假手术组，模型组，人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组，阳性药物对照组，每组5只。采用线栓法制作大脑中动脉栓塞模型。于MCAO术后6h，采用免疫印迹法对CA1 区的pJNK蛋白表达情况进行定量检测。结果：模型组pJNK含量最高;假手术组含量最低;Rg1 20、40 mg/kg组和阳性药物对照组pJNK蛋白含量显著降低，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，其中Rg1 40 mg/kg组pJNK蛋白含量最低。结论：人参皂苷Rg1防治大鼠脑缺血再灌注损伤的机制可能与抑制脑组织pJNK表达有关，且以高剂量效果较好。

【关键词】  人参皂苷Rg1; 脑缺血再灌注; pJNK; 免疫印迹

目前免疫印迹技术是科研中常用的蛋白定量检测方法，该方法具有高效、灵敏等特点。本实验拟采用免疫印迹方法对脑缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion，CIR)后大鼠海马CA1 区神经细胞pJNK的表达进行定量检测，并观察人参皂苷Rg1 对pJNK蛋白表达的影响，以明确人参皂苷Rg1 是否通过调控JNK蛋白的表达来抑制CIR损伤后的神经细胞凋亡。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　取健康雄性SD大鼠，饲养7天后随机分为 6 组：① 假手术组;② 模型组;③ Rg1 10 mg/kg组;④ Rg1 20 mg/kg组;⑤ Rg1 40 mg/kg组;⑥ 阳性药物对照组。每组 5 只大鼠。③～⑤组分别于术前 5天至取材当日连续腹腔注射人参皂苷 Rg1;⑥组注射尼莫地平注射液，①、②组分别注射 1.5 ml等渗生理盐水，均为 1 次/d。

　　1.2 主要实验药品

　　人参皂苷Rg1(纯度>95%)，吉林大学有机化学教研室;尼莫地平注射液，山西亚宝药业，批号071001;兔抗鼠pJNK (Ser63)单克隆抗体，SANTA CRUZ公司;Marker预染蛋白质分子量标准、BCA 、NBT/BCIP、PMSF，碧云天生物技术研究所;其余试剂由辽宁医学院科学实验中心提供。

　　1.3 大鼠右侧局灶性脑缺血模型的制备

　　10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，模型制作采用改良线栓法[1]。线栓采用头端光滑烫圆的直径0.23mm鱼线，由右侧颈总动脉分叉部缓慢向颈内动脉颅内方向插入约(18.5±0.5)mm，使线头通过大脑中动脉起始处，阻断大脑中动脉的血流;假手术组插入深度<15 mm。阻塞后2 h，将尼龙线轻轻拔出行再灌注，再灌注时间为4 h。

　　1.4 免疫印迹检测及强度分析

　　MCAO术后6h,取各组大鼠5只，迅速断头取出右侧海马置于液氮冷冻,-80℃冰箱保存。取冷冻脑组织,加入RIPA裂解液,剪碎、超声波粉碎20s后静置30min, 4℃,12 000r/min 离心20min,留取上清液。用二喹啉甲酸法测定蛋白含量,并按照每20μl含50μg蛋白制成样品， -20℃冰箱保存。按实验室常规上样、电泳、转膜后,5%小牛血清白蛋白室温封闭1～2h。加入一抗(兔抗大鼠pJNK,稀释度为1∶400)4℃孵育过夜,TBST缓冲液洗脱3次,每次5min;二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体,稀释度为1∶200)室温孵育1h,TBST缓冲液洗脱3次, 每次5min; BCIP/ NBT显色;扫描电泳条带,用凝胶分析软件分析电泳条带强度。采用βActin作为内参照。扫描电泳条带,用凝胶分析软件分析各蛋白目的条带的吸光度。根据目的条带与内参照条带吸光度的比值表示待测蛋白含量。

　　1.5 统计学分析

　　数据分析应用SPSS10.0软件，所有数据均用±s表示。多组间差异显著性检验采用单因素方差分析。　2 结果

　　免疫印迹染色结果显示，模型组大鼠大脑右侧海马CA1区pJNK含量最高;假手术组pJNK含量最低;Rg1 20、40 mg/kg组和阳性药物对照组大鼠海马CA1区的pJNK蛋白含量显著降低，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，其中Rg1 40 mg/kg组pJNK蛋白含量最低;Rg1 10 mg/kg组与阳性药物对照组比较有显著性差异(P<0.05)，而Rg1 20、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P>0.05)。见表1，图1。表1 各组大鼠MCAO术后6 h海马CA1区pJNK蛋白表达含量比较注：与假手术组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05;与阳性药物对照组比较，△P<0.05;与Rg1 10 mg/kg组比较，▲P<0.05;与Rg1 20 mg/kg组比较，★P<0.05。

　　3 讨论

　　CIR损伤最终导致神经细胞凋亡或坏死。因此，干预神经细胞凋亡过程是治疗CIR损伤的关键之一。研究表明，cjun氨基末端激酶(cjunNH2terminal kinase，JNK)信号转导通路是目前已被证实的一条导致细胞凋亡的重要信号通路[2]。JNK一旦被激活，称为pJNK，立即从细胞质移位至细胞核，并可以引起级联反应，最终导致细胞凋亡。

　　研究证实，人参皂苷Rg1 具有抑制多巴胺能样神经元JNK活化的作用。周宜灿等[3]采用尼氏染色、TUNEL、免疫组化染色研究人参皂苷Rg1 抗帕金森病小鼠黑质神经细胞凋亡时发现，人参皂苷Rg1可以通过显著抑制JNK的磷酸化水平，降低神经细胞的凋亡率;刘江等[4]采用免疫组化、免疫印迹技术研究人参皂苷Rg1 对抗MPTP介导的帕金森病小鼠的黑质神经细胞凋亡，发现人参皂苷Rg1可以通过显著抑制JNK的磷酸化水平，降低多巴胺能神经细胞的凋亡率;我们推测人参皂苷Rg1可能通过抑制JNK的磷酸化，降低缺血缺氧区神经细胞的凋亡。

　　本实验结果显示：假手术组有少量pJNK阳性细胞;与假手术组比较，模型组大鼠海马CA1 区神经细胞可见大量pJNK阳性细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，这一实验结果与以往文献报道基本一致[5];与模型组比较，Rg1各治疗组pJNK的阳性细胞明显减少，提示人参皂苷Rg1具有抑制CIR大鼠pJNK表达的作用;人参皂苷Rg1各治疗组分别与阳性药物对照组比较，10 mg/kg组神经细胞pJNK的表达虽然得到一定程度的抑制，但与阳性药物对照组比较仍有显著性差异(P<0.05)，Rg1 20、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异，其中40 mg/kg组效果优于20 mg/kg组，提示人参皂苷Rg1在抑制神经细胞凋亡方面存在剂量-效应关系，即在一定范围内，随着药物剂量的增加，抑制神经细胞凋亡的效果也更为明显。本结果也提示人参皂苷Rg1 可能通过抑制JNK蛋白的活化从而抑制CIR损伤后的神经细胞凋亡，以发挥其对缺血性脑损伤的保护作用。

　　(A假手术组，B模型组，C Rg1 10 mg/kg组，D Rg1 20 mg/kg组，E Rg1 40 mg/kg组，F阳性药物对照组)

　　图1 各组大鼠MCAO术后6h海马CA1区pJNK蛋白含量电泳条带

【参考文献】
  　　1 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989,20(1):84～91.

　　2 Okuno S,Saito A,Hayashi T,et al. The cJun Nterminal protein kinase signaling pathway mediates Bax activation and subsequent neuronal apoptosis through interaction with Bim after transient focal cerebral ischemia. J Neurosci,2004, 24(36):7879～7887.

　　3 周宜灿,陈晓春,朱元贵,等.人参皂苷Rg1对帕金森病小鼠黑质JNK细胞凋亡通路的影响.解剖学报,2003,34(5):477～481.

　　4 刘江,李冉,刘丽娜,等.JNK通路介导帕金森病小鼠黑质神经元丢失及人参皂甙Rg1的保护作用.现代预防医学,2008,35(10):1973～1975.

　　5 Gao Y,Signore AP,Yin W,et al. Neuroprotection against focal ischemic brain injury by inhibition of cJun Nterminal kinase and attenuation of the mitochondrial apoptosis signaling pathway.J Cereb Blood Flow Metab,

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