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作者：庄晓燕 杨菁 李华侃 于冬梅 王建
【摘要】 目的：制作热盛胃出血小鼠模型，探讨墨旱莲对其止血的机制。方法：以等量的附子、干姜、肉桂、党参、黄芪、辣椒水煎剂(1g/ml)给小鼠灌服，每日1次连服10d后，尽食16 h，给模型组腹腔注射消炎痛并灌服乙醇，制成热盛胃出血模型;并对其中3组灌以不同剂量的墨旱莲水煎剂。1.5 h后摘眼球取血，测量血小板聚集率等。解剖小鼠取胃观察并记录胃黏膜出血点。结果：热盛胃出血小鼠模型制作成功。其胃黏膜出血点较空白对照组明显增多(P<0.01)，血小板积聚率也明显下降。而不同浓度的墨旱莲水煎剂对热盛胃出血小鼠模型均有明显止血作用，其胃黏膜出血点较模型对照组明显减少(P<0.01);血小板积聚率也明显升高(P<0.05或P<0.01)，且呈计量依赖性。结论：热盛胃出血小鼠模型制作成功，该模型适宜进行临床热盛胃出血疾病的研究;不同剂量的墨旱莲水煎剂对热盛胃出血小鼠模型均有明显止血作用，提示墨旱莲水煎剂在临床可以用来治疗热盛胃出血疾病。
【关键词】 胃出血; 模型; 墨旱莲; 止血; 临床意义
墨旱莲又称鳢肠、旱莲草、野菊花等，始载于《唐本草》，《本草纲目》云：鳢，乌鱼也，其肠也乌，此草柔茎，断之有墨汁出，故名，俗称墨菜是也。细茎颇如莲房状，故得莲名[1]。墨旱莲是菊科植物鳢肠(Eclipta prostrate L)的干燥地上部分。其味酸、甘，性凉;入肝、肾、胃经，又能入血分;具有滋补肝肾、凉血、止血的功能。墨旱莲最早应用于出血性疾病的治疗，以墨旱莲为君药配伍其他药物，或用单味墨旱莲用于血症，治疗鼻衄、咳血、吐血、便血、产后出血、外伤出血及药物引起的溶血等作用显著，有“止血神药”之称[2]。而对于墨旱莲止血机理的研究目前国内外还仅仅限于凝血时间、出血时间和收缩血管方面进行测定，尚缺少深入的研究，除本课题组外还没有采用动物模型进行研究的报道。故本实验根据中医理论，结合近代研究，制作热盛胃出血小鼠模型，通过给予不同浓度的墨旱莲水煎剂对热盛胃出血小鼠模型治疗，观察并测定相关指标，研究墨旱莲止血的机理。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 昆明种小鼠雌雄各半，体重30～50g;由辽宁医学院实验动物中心提供。
1.1.2 实验药品与试剂
墨旱莲、附子、肉桂、干姜、党参、黄芪，购自锦州市成大方圆药店;消炎痛，山西临汾云鹏药业有限公司，批号：20030507;其余均为国产分析纯试剂。
墨旱莲水煎剂的制备：称适量墨旱莲，用蒸馏水漂洗3次，烘箱干燥后用粉碎机粉碎，过100目筛;用蒸馏水浸泡30min三层纱布过滤4次，置电热套中煎煮，所得煎出液，加热至沸腾，再用文火煮1h，所得煎出液，混合后减压浓缩至1g/ml。
热盛胃出血模型药的制备：将等量的附子、干姜、肉桂、党参、黄芪、辣椒用蒸馏水浸泡30min，加热至沸腾，再用文火煮1h，三层纱布过滤3次所得煎出液，混合后减压浓缩至1g/ml。
消炎痛注射液的制备：将消炎痛片碾碎，溶于蒸馏水中，过滤至澄清后，浓缩至7.5mg/ml。
血小板积聚率相关试剂的配制：磷酸盐缓冲液的配制 称取氯化钾2g、磷酸二氢钾2g、氯化钠80g、磷酸氢二钠8.8g、加蒸馏水1000ml，调节pH值至7.4;EDTA缓冲掖的配制0.07mol/LEDTA3ml加磷酸盐缓冲液5ml，再加蒸馏水12ml;EDTA甲醛缓冲液的配制 0.07mol/LEDTA3ml加4%甲醛溶掖5ml，再加磷酸盐缓冲液2ml，加蒸馏水12ml，调节pH值至7.4。
血小板稀释液的配制：将0.16mol/L尿素、1.7mmol/L枸橼酸钠、40%甲醛各0.1 ml 加蒸馏水至100ml，过滤后4℃保存。
1.3 主要仪器
旋转蒸发器(R201BⅡ)，上海申顺生物科技有限公司;连续变倍体式镜(XST18型)，上海蒲光显微仪器有限公司;普通光学显微镜(4XBE型)，上海长方光学仪器有限公司;调节电热套(DZTW型)，上海仕元科学器材有限公司。
2 方法
2.1 实验动物分组及热盛胃出血小鼠模型的制作
将体重30～35g的昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组，Ⅰ组为空白对照组，Ⅱ～Ⅴ组为热盛胃出血小鼠模型组。其中Ⅱ组为模型对照组，Ⅲ～Ⅴ组分别以墨旱莲水煎剂治疗;Ⅲ组为低剂量用药组，Ⅳ组为中剂量用药组，Ⅴ组为高剂量用药组;墨旱莲水煎剂用量分别为5mg/g鼠重、 10mg/g鼠重、20mg/g鼠重。各组动物均饲以普通饲料，其中Ⅱ～Ⅴ组小鼠每日灌服热盛胃出血模型药5g/kg鼠重1次;Ⅰ组小鼠灌以等量生理盐水;连续给药10日后，尽食16h;Ⅱ～Ⅴ组小鼠腹腔注射7.5mg.ml消炎痛的蒸馏水溶液0.01ml/g鼠重，Ⅰ组小鼠灌以等量生理盐水;30min后，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组小鼠以墨旱莲水煎剂灌胃，用量分别为5mg/g鼠重; 10mg/g鼠重;20mg/g鼠重;Ⅰ组、Ⅱ组小鼠灌以等量生理盐水;3h后重复灌胃1次。第2次灌胃2h后，Ⅱ～Ⅴ组小鼠再灌服50%乙醇0.01ml/g鼠重，Ⅰ组小鼠灌以等量生理盐水。1.5h后取材检测。
2.2 指标检测
2.2.1 胃黏膜出血点计数 断颈处死小鼠取胃，结扎幽门，从食管注入10% 甲醛溶液2ml ，结扎贲门后，将胃浸入10%甲醛溶掖中固定10min后取出，沿胃大弯剪开，铺平，在连续变倍体式镜下观察并计数胃黏膜出血点。
2.2.2 血小板集聚率的测定 每只动物用两个试管，一个试管注入EDTA甲醛缓冲液2ml，另一个试管注入EDTA缓冲液2ml;摘取小鼠眼球取血两份，均为0.4ml分别注入两个试管中混匀，室温下放置15min;以1000r/ min离心8 min，取上层富含血小板血浆;在普通光学显微镜下计数两份富含血小板血浆中血小板数的差值与不含甲醛的富含血小板血浆中血小板数的比值(相当于聚集后沉淀的血小板数与总的血小板数之比)，即反映血小板的集聚程度。
2.3 统计学处理
所有数据均以(x±s)表示，并进行t检验统计分析。 3 结果
3.1 热盛胃出血小鼠模型制作成功
Ⅱ组每只小鼠的胃黏膜出血点为23.5±3.75个，Ⅰ组每只小鼠胃出血点仅0.6±0.7个，两者有极明显差异，P<0.01;Ⅰ组血小板积聚率45.57±7.31%Ⅱ组血小板积聚率32.49±5.94%，Ⅱ组与Ⅰ组比较明显下降，P<0.01。
3.2 不同浓度的墨旱莲水煎剂对热盛胃出血小鼠模型均有明显止血作用，且有计量依赖性表1 墨旱莲水煎剂对热盛胃出血小鼠模型的止血作用注:与Ⅱ组比较， #P<0.05 ,**P<0.01。
4 讨论
在临床上消化道出血是常见病和多发病。胃出血是消化道出血中最常见的病症。本实验以等量的附子、干姜、肉桂、党参、黄芪、辣椒制成的水煎剂，给小鼠灌胃，并注射消炎痛，灌服乙醇。因为等量的附子、干姜、肉桂、党参、黄芪、辣椒制成的水煎剂，属热药，给小鼠灌胃后，小鼠已处在热盛状态。《内经》记载“阳热过剩可迫血妄行。”消炎痛类药最大的副作用是诱发上消化道出血，过量饮酒也可以诱发胃出血。因此在热盛胃出血模型药、消炎痛和乙醇的共同作用下，结果由表1可见，Ⅱ组与Ⅰ组相比胃黏膜出血点极显著增加(P<0.001)，血小板积聚率明显下降(P<0.01)。同时凝血酶原时间和部分凝血活酶时间延长，血小板计数、纤维蛋白原明显减少(P<0.01)[3]，说明热盛胃出血小鼠模型组确实存在止血、凝血机能障碍;提示热盛胃出血小鼠模型制作成功。该模型在临床用以胃出血的研究具有重要意义。
由表1可见，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组小鼠以墨旱莲水煎剂灌胃，与Ⅱ组比较其胃黏膜出血点明显减少(P<0.01)，血小板积聚率与Ⅱ组比较明显升高(P<0.05 或P<0.01)，并且呈计量依赖性。说明不同浓度的墨旱莲水煎剂对热盛胃出血小鼠模型均有明显的止血作用。
止血是机体的保护功能。正常的止血功能是由血管、血小板和血液凝固来完成的。三者相互联系，协同作用。血管的止血功能与其结构和代谢有关，与血小板也有密切关系[4]。血液凝固是人体生理止血机构的重要组成部分。血液凝固过程是在凝血因子参与下，使溶解的纤维蛋白原变为纤维蛋白凝胶的过程[5]。若达到止血的目的，需要一系列生物化学反应过程。参与的物质主要有血小板和各种凝血因子，其中大部分属蛋白质，但也有小分子物质如 Ca2+。在正常机体内，血液中流动的血小板是没有粘性的，也不互相积聚成团。当血管壁破损时血小板才迅速定位于应当形成止血栓的位子，并与血管内皮暴露出来的胶原纤维和基膜结合，快速黏附到血管壁上，继之血小板被活化，同时发生聚集，并释放出多种凝血物质。在止血的初级阶段血小板的积聚十分重要，由表1可见墨旱莲水煎剂能显著地提高血小板积聚率(P<0.05 或P<0.01)，促使血小板积聚在破损血管处，形成血小板栓子。墨旱莲水煎剂由于能增加血小板积聚率说明有很好的止血作用。墨旱莲水煎剂同时能使凝血酶原时间和部分凝血活酶时间缩短(P<0.05 或P<0.01)，使血小板计数显著增加(P<0.05 或P<0.01)，纤维蛋白原明显增加(P<0.05 或P<0.01 )[3]。
综上所述，说明墨旱莲水煎剂对热盛胃出血小鼠有明显的止血作用，是通过促进凝血过程、影响血小板的生成和积聚、增加血液的粘稠度、收缩血管及抑制纤维蛋白溶解系统来实现的。这与旱墨莲中含有黄酮类、鞣质和无机盐有关。墨旱莲中含有丰富的草酸钙，经过水煎后，有利于钙的游离，从而释放出可溶性Ca2+[6]，因此，旱墨莲止血作用也与墨旱莲水煎剂含有丰富的Ca2+ 有关。
关于墨旱莲止血机理的研究，在国内外还仅仅对凝血时间、出血时间和收缩血管方面进行研究。若应用热盛胃出血小鼠模型进行研究，定会使其研究在原有的基础上更加深入，更加贴近临床，为热盛胃出血疾病的治疗提供更佳的前景。
【参考文献】
1 新编中药学词典编写组，新编中药学词典.天津科学技术出版社，1996，1332.
2 江苏新医学院.中药大词典.上海人民出版社,1977，2615.
3 王建,白秀珍,杨学东.墨旱莲对热盛胃出血止血作用的研究.数理医药学杂志，2005，18(4)：375.
4 小菅卓夫(日),等.止血生药中有效成分的研究关于止血生药的止血效果.药学杂志，1981，101(6)：501.
5 张昌颖，主编.生物化学.北京，人民卫生出版社,1985，2：440.
6 Sikroria B C，Srivastava SJ，Niranjan GSphytochemical studies on Eclipta albaJIndian Chen Soc，1982，59(7)：501. |
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发表于 2014-6-1 13:12:54
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