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摘要】 目的：观察当归注射液对缺血再灌注损伤心肌细胞内FAK的表达及临床的意义。方法:将35只SD大鼠随机分成4组(n =10):正常对照组(n=5);假手术组(n=10);缺血再灌注组(n=10);当归治疗组(n=10) ,建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色;观察各组动物心肌细胞内粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)表达的变化。利用HPIAS2000图像分析系统测定FAK在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组：心肌细胞内可见大量的棕黄色颗粒沉积，FAK表达呈阳性;假手术组：心肌细胞内可见一些棕黄色颗粒，FAK表达呈阳性;缺血再灌注损伤组：心肌细胞内可见少量和未见棕黄色颗粒，FAK表达呈阴性;当归治疗组：心肌细胞内可见密集分布的棕黄色颗粒，FAK表达呈阳性。图像分析结果显示：正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间FAK表达的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01);正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间FAK表达的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞有重要的保护作用。
【关键词】 当归注射液; 缺血再灌注; 心肌; FAK 缺血
再灌注损伤( Ischemiareperfusion injury) 或称再灌注损伤,是指组织缺血一段时间,当血流重新恢复后,细胞功能代谢障碍及结构破坏反而较缺血时进一步加重,器官功能进一步恶化的综合征[1]。缺血是供血障碍引起的组织供血不足的病理表现, 组织缺血导致的疾病称缺血性疾病,是可以发生在多种组织器官上的常见疾病。再灌注是指组织缺血后恢复供血的过程, 缺血再灌注实际上包括缺血和再灌注两个方面, 缺血是引起疾病的原因, 也是再灌注的条件[2]。
当归为伞形科(Umbrelliferae)植物的干燥块根,药性甘、辛、温,入肝、心、脾经, 具有补血活血、调经止痛、润燥滑肠等功效[3]。当归中含有19种氨基酸, 23种微量元素及维生素A、维生素B、磷脂等物质[4]。当归的药用价值早已为人们所认识, 其药理作用主要是：① 促进机体免疫;② 对呼吸系统的作用;③ 对血液循环系统的作用，有文献报道[2]。冠心病患者应用当归注射液治疗能平衡和抑制血小板聚集的作用。当归具有钙通道阻滞作用, 拮抗钙超载, 对心肌缺血再灌注所致心肌损伤有保护作用。中药对心肌缺血的治疗有其独特性和有效性，尤其是中药具有毒副作用小、效果确切的特点[5]。近年来，有不少学者对中药预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用进行了研究与探索。
FAK是一种非受体型酪氨酸激酶,与酪氨酸激酶2(prolinerich tyrosine kinase 2, PYK2)及细胞黏着激酶β(cellular adhesion kinaseβ,CAKβ)组成FAK家族[6]。FAK抑制细胞凋亡[7]。FAK是锚定依赖细胞的生存信号,肿瘤细胞FAK表达受到抑制时,可引起细胞凋亡。癌细胞FAK表达的升高,通过抑制锚定依赖状态下的细胞凋亡而进行不断的生长[8]。FAK的高表达能使细胞外存活信号不断放大,抑制肿瘤细胞失去细胞黏附后的失巢凋亡,促进肿瘤细胞增殖和迁移。
本实验采用免疫组织化学方法观察当归注射液对缺血/再灌注过程心肌细胞内FAK的表达,探讨当归注射液对心肌缺血/再灌注损伤的作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物模型制备及分组 选用健康雄性Wistar大鼠(SPF级)35只,体重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠4.5 mg·(100 g)-1,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸[ 呼吸频率60 次·min-1 ,潮气量2ml·(100g)-1],沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/ 开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成4组: 正常对照组(不做任何处理);假手术组(丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎);缺血再灌注损伤组(IR)( 缺血/ 再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml / kg，结扎左冠状动脉前降支45min ,再灌注120 min );当归注射液预处理组(在结扎前20min，静脉注射当归注射液0.8ml/ kg , 其它处理同缺血/ 再灌注组)。
1.2 主要试剂
25%当归注射液(武汉大学中南医院制药厂);即用型兔抗鼠FAK单克隆抗体，即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸。以上试剂均购于北京中山生物技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色。
1.3.2 免疫组织化学SP法检测FAK相关抗原 主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，Ki67均采用高压抗原修复，正常羊血清处理10 min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10 min，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组。
1.4 免疫组织化学结果判断
FAK以胞膜和胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对FAK抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
1.5 统计学处理
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和q 检验，检验水准α为0.05。
2 结果
Ki67的表达，正常对照组：心肌细胞内可见大量的棕黄色颗粒沉积，FAK表达呈阳性;假手术组：心肌细胞内可见一些棕黄色颗粒，FAK表达呈阳性;缺血再灌注损伤组：心肌细胞内可见少量和未见棕黄色颗粒，FAK表达呈阴性;当归治疗组：心肌细胞内可见密集分布的棕黄色颗粒，FAK表达呈阳性。图像分析结果显示：正常对照组：FAK表达的平均光密度为2.895±0.0158，假手术组：FAK表达的平均光密度为2.257±0.0117，缺血再灌注损伤组：FAK表达的平均光密度为0.597±0.0104;当归治疗组：FAK表达的表达的平均光密度为2.740±0.0193;正常对照组：FAK表达的阳性面积率为3.281±0.0234，假手术组：FAK表达的阳性面积率为2.965±0.0220，缺血再灌注损伤组：FAK表达的阳性面积率为1.021±0.0159;当归治疗组：FAK表达的表达的阳性面积率为3.154±0.0196。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P<0.05)。经q 检验，正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间FAK的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01);正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间FAK平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0.05)。见表1。表1 当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后各组 FAK表达的平均光密度和阳性面积率注：* 正常对照组、假手术组、当归治疗组与缺血再灌注损伤组比较，P<0.001;△ 当归治疗组、假手术组与正常对照组比较，P>0.05。
3 讨论
缺血再灌注过程中,机体可通过多种途经产生氧自由基,氧自由基与生物膜发生一系列反应,可破坏心肌细胞结构、损伤心肌细胞膜, 产生大量的脂质过氧化物。自1977年Hearse首次提出缺血再灌注损伤慨念以来，已逐渐引起医学界的高度重视。大量动物实验显示，氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡等均可能参与再灌注损伤的发病过程。目前虽然对缺血或缺血再灌注损伤的确切机制还不十分清楚,但巳经知道损伤的临床结局主要就是细胞死亡[9]。
防治措施总是建立在对疾病机制的理解基础上。从预防角度,心肌缺血预处理和心肌药物性预处理(如腺苷) 都是启动内源性保护机制的有效方法。尽量缩短缺血时间,用低温和停搏液保护心肌,运用控制性再灌注手段调节再灌注的温度、压力等条件,改变再灌注液的成分,都是行之有效的办法[10]。
研究发现再灌注损伤中也存在细胞凋亡,且凋亡抑制剂对缺血-再灌注损伤有较好的保护效果。由于人类基因组计划的突破,人们又开始从基因水平寻找缺血性心肌坏死的保护机制。对干细胞研究的热门,又有学者开始研究移植干细胞来修复坏死心肌。随着对缺血-再灌注损伤机制研究的进一步深入,对缺血-再灌注损伤的防治也必然更加有效[11，12]。 多数学者认为,缺血再灌注损伤可能是多种因素共同作用的结果,相互作用,相互促进。缺血再灌注时生成的自由基可促进钙超载,胞浆内游离钙增加又加速自由基的产生,共同导致缺血再灌注损伤;血管内皮细胞和中心粒细胞作为缺血再灌注时自由基、细胞粘附分子及其它生物活性物质的重要来源,在缺血再灌注损伤的发生发展中亦起重要作用。此外,细胞代谢紊乱也参与缺血-再灌注损伤的发生当归含有阿魏酸、多种磷脂、人体必需氨基酸和微量元素等[13，14]。目前已证明,当归对心血管系统、血液造血系统、免疫系统、抗氧化和清除自由基等多方面均有肯定的药理作用。在心血管疾病中,经常发生缺血再灌注损伤,其机制可能是多因素的,但主要有三个环节:即能量代谢失常、钙超载和氧自由基生成,其中氧自由基是造成缺血再灌注损伤的直接原因[15] 。
FAK抑制细胞凋亡。FAK是锚定依赖细胞的生存信号,肿瘤细胞FAK表达受到抑制时,可引起细胞凋亡。癌细胞FAK表达的升高,通过抑制锚定依赖状态下的细胞凋亡而进行不断的生长。FAK的高表达能使细胞外存活信号不断放大,抑制肿瘤细胞失去细胞黏附后的失巢凋亡,促进肿瘤细胞增殖和迁移[16]。
本实验数据表明: 正常对照组：心肌细胞内FAK呈高表达;假手术组：心肌细胞内FAK的表达也较高;缺血再灌注损伤组：心肌细胞内FAK表达较低;当归治疗组：心肌细胞内FAK表达较高。图像分析结果显示：正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间FAK表达的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01);正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间FAK表达的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05) 。实验结果提示:当归可通过抑制心肌细胞的凋亡,增强细胞的移动性,使心肌细胞功能活动、细胞代谢都得到改善。
本实验结果为临床防止缺血再灌注损伤提供了一个新的思路,其确切临床价值有待于进一步的研究和证实。
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发表于 2014-6-1 13:19:06
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