人胆囊癌耐砷细胞株GBCSD/As的建立及其凋亡相关基因差异表达检测

jz066520 · 发表于 2014-6-1 13:19:58

   作者：吴达龙张成文何小伟

【摘要】  目的: 建立耐三氧化二砷(arsenic trioxide, As)的人胆囊癌细胞株GBCSD/As，分析GBCSD/As细胞株和相应的敏感细胞株GBCSD之间多种凋亡相关基因的差异表达, 探讨As所致的胆囊癌耐药与多种凋亡相关基因之间的相关性。方法:采用As浓度递增法体外诱导人胆囊癌细胞株GBCSD,建立耐药细胞株GBCSD/As; MTT法测定As的细胞毒作用;利用含458个凋亡相关基因的人细胞凋亡相关基因cDNA芯片检测耐药细胞株凋亡相关基因的表达变化。结果: 经8个月诱导培养, 成功构建耐As的人胆囊癌细胞株GBCSD/As，与 GBCSD细胞相比，其对As的耐药倍数为13.6倍; 基因芯片检测结果表明, 与 GBCSD细胞相比，GBCSD/As中有17个基因的表达水平出现2倍以上的明显改变，其中6个基因表达增强，11个基因表达下调。结论：17种凋亡相关基因与GBCSD/As细胞的耐药密切相关，提示细胞凋亡调控相关基因表达异常可能是胆囊癌As耐药的分子机制之一。

【关键词】  胆囊癌; 耐药; 凋亡; 三氧化二砷

三氧化二砷( arsenic trioxide, As)是中药砒霜的主要成分。20世纪80年代, 我国学者首次报道，As对急性早幼粒细胞性白血病有显著效果, 此后，As迅速成为世界范围内抗癌药研究的热点[1]。体外研究表明，As有广泛而独特的抗癌机制, 对耐常用化疗药物的实体瘤细胞也有抑制作用，在实体肿瘤治疗方面也显示了一定的疗效，尤其对肝胆恶性肿瘤效果明显，其作用机制与抑制肿瘤生长、诱导细胞凋亡及抑制新生血管生成等有关[2～4]。2000年，美国FDA正式批准As用于急性早幼粒细胞性白血病的治疗。2004年As被中国国家食品与药品管理局正式批准用于肝、胆恶性肿瘤的治疗。

　　与其它化疗药物一样，As在用于实体瘤的治疗时也出现耐药现象，而目前对As的耐药机制却没有明确认识。鉴于As的主要作用机制是诱导细胞凋亡，本研究首先建立了耐As的胆囊癌细胞模型GBCSD/As;然后采用含458个细胞凋亡相关基因的人细胞凋亡相关基因cDNA芯片, 高通量分析人胆囊癌细胞株 GBCSD与耐药细胞株GBCSD/As的基因表达谱的表达差异, 探讨As所致的胆囊癌耐药与多种凋亡相关基因之间的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞和主要试剂

　　人胆囊癌细胞株GBCSD为本实验室保存,使用含10%胎牛血清的RPMI1640(Gibco BRL公司)培养液，置于含5% CO2、37℃、95%湿度的CO2 孵箱中培养; 噻唑篮(MTT) 购自上海生工生物制品公司; As购自美国Sigma公司,用0.9%氯化钠配制成1 mmol/L的储存液，使用前稀释到所需浓度。人细胞凋亡相关基因cDNA芯片(SBC.R.HC.101.11)由生物芯片上海国家工程研究中心研制，含458个细胞凋亡相关基因、4个重复阵列。

　　1.2 耐药细胞的诱导

　　以逐步提高As浓度的方法诱导人胆囊癌细胞株GBCSD[5]。GBCSD细胞按1×104 细胞/ml浓度接种于培养瓶，24 h后加入终浓度0.5 μmol/L As，继续培养、传代，至细胞能在此浓度下正常生长，加大As剂量并重复上述诱导过程。As 的诱导剂量为0.5～5.0μmol/L，整个诱导过程持续8 个月。

　　1.3 细胞存活率测定[5]

　　取生长旺盛细胞，稀释后接种于96孔平底培养板中(每孔含4×103 细胞)，置CO2培养箱中培养。接种24 h后加入不同浓度的As(0、0.1、0.3、1.0、3.0和10 μmol/L )，使液体总量达到每孔200μL。继续培养72 h，弃去培养液，每孔加 200 mg/L MTT 25μL，培养4 h，弃去MTT，每孔加 DMSO 150μL ，在微孔板震荡器上振荡10 min，成色产物溶解后用酶标仪测570 nm 处吸光度值;以不加药的瘤细胞组为对照，求给药组IC50。

　　1.4 细胞总RNA提取

　　参照Trizol试剂说明书抽提细胞总RNA，用紫外分光光度计进行纯度检测，并用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

　　1.5 探针制备[6]

　　按每份探针50μg总RNA逆转录生成cDNA, 并在第一链合成中掺入荧光标记dUTP，用Cy5dUTP 标记GBCSD/As细胞、Cy3dUTP标记GBCSD细胞，制成探针，用S200 DNA纯化柱纯化。

　　1.6 芯片杂交[6]

　　混合两种荧光标记探针,真空抽干后溶解于13 μL杂交液中。探针在95℃变性2 min后，立即加在已点有458个靶基因并经预杂交的基因芯片上，用盖玻片覆盖后置于杂交舱中;密封，42℃杂交箱内杂交过夜。然后揭开盖玻片，用洗涤液洗涤10 min，晾干后扫描。

　　1.7 检测与分析

　　用ScanArray 4000扫描仪扫描芯片，并用GenePixPro3.0软件分析Cy3和Cy5相对信号强度和比值。符合以下条件判定基因有差异表达：Cy5和Cy3信号比值<0.5或>2.0。2 实验结果

　　2.1 耐药细胞株GBCSD/As的建立

　　采用浓度递增诱导法, 历经8 个月, As浓度从0.50μmol/L增到5.0μmol/L, 分6个浓度梯度给药, 共传37 代, 成功构建了人胆囊癌耐砷细胞株，命名为GBCSD/As。GBCSD/As细胞能在5.0μmol/L 的As浓度下稳定生长。

　　MTT法测得GBCSD/As和GBCSD细胞对As作用的IC50 分别为12.9±1.6μmol/L和0.95±0.16μmol/L, 因而GBCSD/As细胞对As的耐药倍数为13.6倍。

　　2.2 细胞凋亡基因芯片检测

　　图1为GBCSD/As和GBCSD细胞叠加扫描图。本项研究中将信号值差异2倍以上者确定为差异表达基因，通过对实验数据的统计分析发现，在被检测的458个凋亡相关基因中，与GBCSD相比，GBCSD/As细胞的差异表达基因有有17个,其中6个基因表达增强,11个基因表达下调，见表1。表1 GBCSD/As与GBCSD 细胞差异表达的凋亡相关基因

　　3 讨论

　　肿瘤耐药是多年来未能解决的难题，是肿瘤化疗失败的主要原因之一。肿瘤的耐药机制非常复杂，常常是多种因素作用的结果。不同来源的化疗药物由于作用机制不尽相同，其耐药机制可能相差很大[7]。深入研究各种化疗药物的耐药机制，并依此寻找各种耐药逆转途径，已成为目前肿瘤治疗领域的热点课题。

　　在临床用药过程中，As的耐药现象严重影响了As的治疗效果[1,2]，急需对As的耐药机制进行深入研究, 进而发展新的逆转耐药方法。由于As是近年来才广泛用于临床的抗肿瘤新药，对其耐药机制方面的研究较少，国内未见报道，国外也仅有零星报道。如Lee等[8]报道，耐As细胞的细胞膜多药耐药相关蛋白2表达增高，后者能将As泵出细胞外; Davison等[9]发现耐As的白血病细胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)增高，用GSH合成抑制剂丁硫氨酸亚矾胺预处理该细胞以耗竭细胞内的GSH，能部分逆转白血病细胞对As的耐药性。

　　由于As的作用机制独特，其耐药机制错综复杂，绝非单一因素能够完全解释，寻找新的As耐药相关基因无疑是非常必要的。传统的筛选差异功能基因的方法如消减杂交、差示PCR等具有操作烦琐、筛选基因有限、假阳性率高等缺点, 不能用于高通量的筛选[6]。近年来迅速发展起来的基因芯片技术为我们提供了进行高通量分析不同种类基因与肿瘤耐药相互关系的平台, 为进一步探讨肿瘤耐药机制、寻找逆转耐药新靶点创造了条件[6]。

　　本研究采用As浓度递增法体外诱导人胆囊癌细胞株 GBCSD，成功建立了耐As的人胆囊癌细胞株 GBCSD/As。与亲代细胞相比，GBCSD/As细胞对As 的耐药倍数增加13.6 倍。采用生物芯片上海国家工程公司提供的人细胞凋亡相关基因cDNA芯类(共含458个细胞凋亡相关基因), 高通量分析GBCSD/As与GBCSD细胞的凋亡相关基因表达谱的表达差异，结果显示，在458个凋亡相关基因中，有17个基因出现2倍以上的明显改变;其中HSPE1、TRIP、MYD88、MYC、TRAF6、APC等6个基因表达增高，而CASP14、CRADD、BLK、BCL2L11、BAX、CCNB1、GSTM4、TNFSF8、CHEK1、CASP7、TNFSF6等l1个基因表达下调。

　　实体瘤对As的耐药涉及多种因素，人胆囊癌耐As细胞株GBCSD/As的建立为进一步研究实体瘤尤其是胆囊癌的相关耐药机制提供了一种有效的体外细胞模型。本研究应用基因芯片技术筛选出了17个在GBCSD/As细胞中差异表达最显著的基因,进一步研究这些基因将有助于阐明As所致胆囊癌耐药的机制,从而为逆转胆囊癌耐药奠定基础。

【参考文献】
  　　1 张鹏, 王树叶. 三氧化二砷治疗72例急性早幼粒细胞性白血病. 中华血液学杂志, 1996,17 (2):58～62.

　　2 陈鑫，吴诚义. 三氧化二砷在实体瘤中的研究现状. 临床肿瘤学杂志，2003,8(3):229～231.

　　3 邬红霞, 于志坚. 三氧化二砷治疗肝胆系统恶性肿瘤机理及临床研究进展. 南通大学学报(医学版)，2006,26(2):154～156.

　　4 凌跃新, 艾志龙, 锁涛, 等.三氧化二砷抑制人胆囊癌细胞生长及对细胞周期蛋白D1表达的影响. 中国癌症杂志,2007 17(11):867～870.

　　5 吴达龙,吕焕章，黄丰,等.本芴醇衍生物LY980503逆转人乳腺癌多药耐药细胞株MCF/DOX对多柔比星的耐药性.中国药理学与毒理学杂志，2002，16(3)：211～215.

　　6 周向东,钱桂生,刘凌志,等. 采用基因芯片技术筛选人小细胞肺癌SH77/CDDP多药耐药相关基因表达谱的研究. 第三军医大学学报,2007,29(4):279～283.

　　7 吴达龙，黄丰,吕焕章，等.乳腺癌耐药蛋白肿瘤多药耐药研究新进展. 癌症，2003，22(4): 441～444.

　　8 Lee TC, Ho IC,Lu WJ, et al. Enhanced expression of multidrug resistanceassociated protein 2 and reduced expression of aquaglyceroporin 3 in an arsenicresistant human cell line. J Biol Chem, 2006,281(27):18401～18407.

　　9 Davison K, Cote S, Mader S, et al. Glutathione depletion overcomes resistance to arsenic trioxide in arsenicresistant cell lines. Leukemia, 2003,17(5):931～940.

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