姜黄素抑制宫颈癌细胞株增殖和诱导凋亡的体外研究

jz066520 · 发表于 2014-6-1 13:20:22

【摘要】  目的：探讨中药姜黄素(Cur)对子宫颈癌SiHa细胞株的增殖抑制和诱导凋亡的作用。方法：以不同浓度的姜黄素(10 umol/L、20 umol/L、30 umol/L )，分12h、24h、48h、72h 4个时间点处理SiHa细胞, 光镜观察细胞形态变化;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率; 用透射电子显微镜及琼脂糖凝胶电泳检测凋亡的发生。结果：姜黄素可抑制SiHa细胞增殖，作用呈明显的时效和量效关系，差异有非常显著性(P<0.01);姜黄素可诱导SiHa细胞凋亡，透射电子显微镜下可见凋亡细胞;琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡典型的DNA“梯状”条带。结论：姜黄素体外对SiHa细胞具有增殖抑制作用和促进凋亡作用。

【关键词】  姜黄素; SiHa细胞; 凋亡; 琼脂糖凝胶电泳

子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤,近年发病率又有上升和年轻化趋势。目前治疗宫颈癌仍以手术为主, 但根治术的5年生存率较低,子宫颈癌对放疗的敏感性也具有个体差异,且放疗后易出现局部转移和复发。因此寻找有效的子宫颈癌化疗药物具有重要意义。本文研究了中药姜黄素对人宫颈癌SiHa 细胞株的增殖和凋亡的影响,为寻找新的有效治疗子宫颈癌的药物提供理论依据。

　　姜黄素是从姜科植物中提取的一种食物色素，具有多方面的药理作用，如抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂及抗动脉粥样硬化等作用[1，2]。近来研究表明，姜黄素可抑制体内、外肿瘤的生长及诱导多种肿瘤细胞凋亡，已成为抗肿瘤研究热点[3，4]，但其对妇科肿瘤宫颈癌的作用报道较少。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人宫颈癌SiHa细胞株购自上海科学院细胞中心。药物: 姜黄素购自美国Sigma公司、苯甲基磺酰氟(PMSF)、DNA Ladder试剂盒(美国Sigma公司); 四甲基偶氮唑蓝(MTT)、胰蛋白酶、RMPI 1640 培养基、小牛血清(北京中山生物公司)。

　　1.2 细胞形态观察

　　每瓶(25cm2) 接种1.5×105细胞,24h后加入不同浓度(10、20、30 umol/L)的姜黄素处理,每天用倒置显微镜观察记录实验组和对照组的细胞形态变化。

　　1.3 MTT 检测

　　以每孔1×105 个SiHa 细胞接种于96孔培养板, 分为空白组(调零)、姜黄素实验组(10、20、30 umol/L) 和对照组(不加药物的细胞)，分别培养12h、24h、48h、72h后加入MTT液，再培养4h，吸弃孔中的培养上清,每孔加入150μl DMSO, 混匀10min ,在酶联免疫检测分析仪570nm处测定各孔吸光度值(A), 抑制率(%)=(1- 实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。重复3次取平均值。

　　1.4 透射电镜观察凋亡细胞

　　以不同浓度姜黄素(10、20、30 umol/L)作用SiHa细胞24h,胰酶消化收集细胞，离心使细胞成团，分别经过固定、脱水、包埋、固化等，以LKB1型超薄切片机切片，经3%醋酸铀枸橼酸铅双染色，在电镜下观察细胞变化。

　　1.5 DNA梯状电泳(DNA ladder)

　　以不同浓度姜黄素(10、20、30 umol/L)作用SiHa细胞24h,胰酶消化收集细胞。按照试剂盒说明提取DNA,并溶于无DNA酶的TE液中,20V电泳4h琼脂糖凝胶电泳后,KODAK DNA analysis 2.0 凝胶成像系统分析。

　　1.6 统计分析

　　采用SPSS11.5统计软件包进行t检验分析。

　　2 结果

　　2.1 光镜下SiHa细胞凋亡的形态学变化

　　正常生长的SiHa细胞为上皮样细胞，帖附生长于培养瓶壁上，细胞平坦。

　　姜黄素处理SiHa细胞24h, 10umol/L 处理组可见细胞间有间隙，细胞形态变化不明显;20 umol/L处理组可见细胞变圆,体积缩小;30umol/L处理组可见圆细胞增多，部分细胞脱落悬浮在培养基中。随着姜黄素作用时间增加，以上变化更明显，至72h，细胞坏死。对照组细胞贴壁生长,几乎无脱落,胞质饱满,生长舒展,相邻细胞生长融合成片。

　　2.2 姜黄素对SiHa细胞增殖的影响

　　姜黄素时间剂量依赖性方式抑制SiHa细胞增殖, 不同浓度姜黄素(10、20、30 umol/L)作用SiHa 细胞不同时间(12h、24h、48h、72h)后，细胞抑制率见图1，与对照组比较，各组差异有显著性意义(P<0.01)。

　　2.3 透射电镜观察SiHa细胞凋亡改变

　　对照组SiHa细胞微绒毛完整而丰富，胞质丰富，胞核无水肿，核膜、质膜完整，核仁清晰。经姜黄素(10、20umol/L)作用的SiHa细胞，可见凋亡发生，微绒毛消失，胞浆空泡;细胞变小、圆，胞质减少，胞膜完整，核膜增厚，染色质碎裂，边集，浓缩，如图2。高浓度姜黄素(30umol/L)作用的SiHa细胞，亦可见坏死细胞，细胞质膜、核膜破碎，细胞崩解，细胞器外溢。

　　2.4 DNA梯状电泳(DNA ladder)

　　以不同浓度姜黄素(10、20、30 umol/L)作用SiHa 细胞24h,提取 DNA经低压琼脂糖凝胶电泳后,呈梯状条带,如图3。　3 讨论

　　肿瘤不仅是增殖和分化异常的疾病,也是凋亡异常的疾病。细胞凋亡普遍存在于大多数肿瘤组织中,与肿瘤的发生、发展及退化有密切的关系[5],已证实细胞凋亡减少或不凋亡等可引起肿瘤的发生,因此诱导肿瘤细胞凋亡已成为近来肿瘤治疗研究的重点[6]，亦成为评估抗癌药物作用能力的重要指标。

　　宫颈癌是女性生殖器官发病率最高的恶性肿瘤，其发生有年轻化趋势。其发生发展与肿瘤细胞的恶性增殖及肿瘤细胞的凋亡减少有关,随着对细胞凋亡研究的深入和发展,人们逐渐认识到诱导细胞凋亡是治疗肿瘤性疾病的一种有效的方法和手段。近年,植物来源的抗肿瘤药在新药开发上显示了巨大潜力,姜黄素来源广泛,价格低廉,无毒副作用，可以用于预防和治疗肿瘤，对多种肿瘤细胞的产生、增殖、转移均具有抑制作用，其可能的作用机制有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成、改变细胞受体连接、阻断肿瘤细胞的生长信号通路等[7～9]。

　　本实验中，不同剂量姜黄素作用于宫颈癌SiHa细胞，从光镜、MTT结果显示姜黄素能有效抑制宫颈癌SiHa细胞增殖,且呈明显的量效关系和时间依赖性;从琼脂糖凝胶电泳结果显示细胞凋亡典型的DNA “梯状” 条带;透射电镜也显示出SiHa细胞出现凋亡的典型特征，表明姜黄素能有效诱导SiHa细胞发生凋亡。本研究结果提示，姜黄素可抑制宫颈癌SiHa细胞增殖,并诱导其凋亡，这与Ruby、张艰、杨海波[10～12]等报道的用姜黄素分别处理结肠癌 HCT116细胞、人永生化上皮HaCaT 细胞时姜黄素可抑制以上细胞株增殖和诱导其凋亡的结果一致。

　　姜黄素如何抑制SiHa细胞增殖和诱导其凋亡，其作用机制有待进一步探讨。通过对姜黄素体外抑制宫颈癌SiHa细胞增殖和诱导其凋亡的实验研究，将可为姜黄素作为治疗宫颈癌的潜力药物及进一步开发姜黄素的抗瘤谱提供一定的理论依据。由于我们的实验结果是在体外状态下获得的, 对其潜在价值的评判还需取决于进一步的活体实验研究效果。

【参考文献】
  　　1 杨俊卿,周岐新,李远宗. 姜黄提取物对实验性动物高脂血症的防治作用研究. 中国药房,2004,15(10)：600～604.

　　2 麦镇江. 姜黄素的药理作用研究进展. 中药材,2004,27(9)：698～691.

　　3 Liu HL, Chen Y, Cui GH, et al. Curcumin, a potent anti-tumor reagent, is a novel histone deacetylase inhibitor regulating BNHL cell line Raji proliferation. Acta Pharmacol Sin, 2005, 26: 603～609.

　　4 Aggar wal BB, Kumar A, Bharti AC. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Res, 2003, 23(1A):363～398.

　　5 Chen Z, Chen GQ, Shen ZX, et al. Treatment of acute promyelocytic leukemia with arsenic compounds: In vitro and in vivo studies. Semin Hematol, 2001，38(1):26～36.

　　6 粟俭,张礼和.药物诱导的肿瘤细胞凋亡研究进展.国外医学,肿瘤学分册,1995,22(1):7～10.

　　7 郑丽端，童强松，吴翠环.姜黄素诱导人卵巢癌细胞株A2780凋亡及其分子机制的研究.癌症,2002,21(12):1296～1300.

　　8 许刚,黄文.姜黄素防治肿瘤的机制研究进展.国外医学:生理病理科学与临床分册,2003,23(2):152～154.

　　9 盛柳青, 颜继忠, 梁万根. 姜黄素研究进展及应用概况. 中国西部科技杂志, 2006(4):14～15.

　　10 Ruby JA, Asok M, Kate D, et al. Curcumin (diferuloylmethane)induces apoptosis through activation of caspase8 , BID cleavage and cytochrome Crelease : its suppressin by ectopic expression of Bcl2 and Bclxl. Carcinogenesis, 2002,23 (1):143～150.

　　11 张艰, 戚好文, 吴昌归. 姜黄素对A549人肺腺癌细胞增殖抑制作用及其机制的研究.中药材,2004 ,27(12): 923～927.

　　12 杨海波，李祺福，等. 姜黄素诱导永生化人 HaCaT细胞凋亡. 解剖学报，2009，40(2)：223～227.

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