抑制CD24表达对SW620细胞粘附能力影响的研究

jz066520 · 发表于 2014-6-2 10:28:56

   作者：邓启亮王新颖王伟飞彭亮青海涛姜泊

【摘要】  目的：检测了DLD1、HT29、HepG2、SW480、SW620中CD24的表达差异，通过抑制SW620中CD24的表达量来观察CD24对细胞黏附能力的影响。方法：利用RTPCR技术及流式细胞术检测各个细胞系中CD24的表达量，筛选出表达量最高的，将其CD24的表达量抑制，看其对基底膜几种介质粘附能力的改变。结果：① RTPCR结果显示在消化道肿瘤细胞株中，CD24的表达是有差异的，其中SW620、HT29、HepG2中CD24的基因表达量高，而SW480及DLD1中CD24的基因表达量低;② 低表达CD24后抑制了SW620细胞对四种不同介质的粘附能力。结论：CD24在消化道肿瘤细胞中表达是有差异的，抑制CD24的表达可以抑制其粘附能力。

【关键词】  CD24; 细胞粘附

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，严重威胁人类的生命健康，在北美、西欧各国大肠癌占全部癌症死亡原因的第3位[1]。CD24是HSA在人类中的同源分子，其定位于染色体的6q21[2，3]，表现出等位基因的多态现象，具有2194个碱基。这个分子被发现出现在鼠造血细胞、胸腺细胞[4]、发育中的神经细胞[5]中，而且最近的研究表明它在人类各种肿瘤中都高表达。CD24是一个粘蛋白样黏附分子[6]，研究表明，CD24在卵巢肿瘤[7，8]、乳腺癌[9]、前列腺癌[10，11]、胰腺癌[12]、肝细胞癌[13]、结肠癌[14，15]、膀胱上皮细胞癌[16]、胆管癌[17]中是具有高表达的。最近Sagiv[14]等发现在90.7%的结直肠腺瘤和86.3%的结直肠腺癌表达CD24。在膀胱癌中[18]，CD24是Ral信号通路的下游目标基因，RalA/B的敲低能降低CD24的含量从而影响细胞肌动蛋白骨架，使细胞失去黏附能力，MTLYCD24mut细胞(CD24缺失细胞)与纤维连接蛋白、层黏连蛋白、胶原Ⅰ和胶原Ⅳ的结合能力下降，以纤维连接蛋白最为明显，诱导MTLYCD24mut细胞株表达CD24后，肿瘤细胞与纤维连接蛋白的结合能力显著增强。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株：HT29、HepG2、 SW480、 SW620和DLD1细胞株均来自ATCC(美国组织培养保藏中心)。

　　1.1.2 CD24SiRNA：由吉玛公司合成片段序列如下：

　　1 CD241555 CAAGUAUUUGGGAAGUGAATT

　　UUCACUUCCCAAAUACUUGAT

　　2 CD241578 GGAAGCUAAUUUGCAUAAATT

　　UUUAUGCAAAUUAGCUUCCAG

　　3 CD24112 CCAGAGUACUUCCAACUCUTT

　　AGAGUUGGAAGUACUCUGGGA

　　4 CD2467 GAUUUAUUCCAGUGAAACATT

　　UGUUUCACUGGAAUAAAUCTG

　　无意义 UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

　　ACGUGACACGUUCGGAGAATT

　　CD24引物参考文献设计，GAPDH片段引物参照文献设计，由上海英俊公司合成，序列：

　　CD24

　　sense 5' GTGAAGGTCGGAGTCAACG3'

　　antise5' GAGTGAGACCACGAAGAGACTGGC3'预计扩增

　　长度222bpGAPDH

　　sense 5' CCATGGAGAAGGCTGGGG3'

　　antise 5' CAAAGTTGTCATGGATGACC3'预计扩增

　　长度197bp

　　2 实验方法

　　2.1 细胞培养和siRNA转染

　　细胞株均在37℃50mL/L CO2条件下，培养于含100mL/L胎牛血清、RPMI1640中，每周传代2次。siRNA干扰技术使用的是Invintrogen公司Lipofectamine2000tm试剂。具体步骤参照试剂盒。

　　2.2 细胞株的筛选

　　2.2.1 半定量RTPCR检测各株细胞CD24mRNA表达水平总RNA的提取按照英俊公司TRIZOL Reagent步骤，各取5 g总RNA，按RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit操作说明合成cDNA扩增CD24和GAPDH采用相同的cDNA上样量(1 L)和反应参数，反应参数设置：94℃预变性5min，然后进入以下36个循环：94℃变性45sec，55℃退火1min，72℃延伸1min。循环完毕，72℃延伸5min。

　　2.2.2 流式细胞检测SW480、HepG2、DLD1、HT29、SW620中CD24蛋白表达水平将细胞消化，并重悬细胞，10uL兔血清(5%封闭)，洗涤后再加入2ulCD24的mAb(1：100)，在4℃放置60分钟;洗涤3次后，避光加入1ul抗鼠的FITC标记的二抗(1：200)，避光4℃放置40分钟;用300ulPBS重悬细胞，上机子检测。

　　2.3 粘附试验

　　Collageon Ⅳ、FN、LN、VN溶液均10 g/mL(1×PBS配制)，每孔75 L，置37℃铺板1h;每孔加100 L兔血清封闭1h，封闭结束后用1xPBS冲洗2次;消化细胞，1×PBS洗涤细胞，将细胞重悬于RPMI1640中，调整细胞浓度为1×108/L;按200 L/孔加入细胞悬液，37℃温育1h;取出96孔板，1×PBS冲洗3次，9每孔加入5mg/ml的MTT20μL和全培200μL;用酶联免疫检测仪在570nm处读取OD值。3 结果

　　3.1 CD24在SW620、SW480、HepG2、DLD1、HT29中表达差异。

　　利用RTRCR(A)及流式细胞术(B)从基因及蛋白方面检测了SW620、SW480、HepG2、DLD1和SW620中CD24的表达差异，其中HT29、HepG2、SW620的表达高，而SW480与DLD1的表达低，结果见图1。图1 细胞间CD24的表达

　　3.2 利用RNA干扰技术敲低CD24的表达

　　选用SW620做为干扰对象，分别转入由吉玛公司设计的4条小RNA干扰片段，经过RTPCR及流式细胞术鉴定发现，4号小片段的干扰效果最佳。

　　3.3 抑制CD24的表达后,细胞黏附能力的改变

　　低表达CD24后抑制了SW620细胞对四种不同介质的粘附能力(collagenⅣ t=13.256,P<0.001;FN t=8.569,P<0.001;LN t=11.43, P<0.001;CollagenⅠ t=3.68,P=0.01)，但以LN为最明显，抑制率为58%，FN、CollagenⅣ、CollagenⅠ分别为31%,52%,11%。见图3。

　　(A)利用RTPCR技术检测CD24的表达，图中所示， SW620CD24/67中CD24的表达量最低 (B) 利用流式细胞术检测干扰CD24的含量。蓝色：对照;红色：SW620V;绿色：SW620CD24/67

　　图2 RNAi干扰CD24的表达

　　图3 低表达CD24后，能降低SW620细胞的黏附能力

　　4 讨论

　　我们利用RTPCR及流式细胞技术检测了5株细胞中的CD24分子的表达差异,发现其在SW480、DLD1中为低表达，而HT29、 HepG2、SW620中表达量很高。其中SW480和SW620细胞株来源于同一51岁男大肠腺癌患者，分别Duke's B期和D期，SW480为大肠原发部位癌细胞，SW620为左锁骨上淋巴结转移灶癌细胞。从这两株细胞可以看出，随着大肠癌的演进，CD24的表达量明显增高，是否说明CD24与大肠癌的演进有关。有人[14]曾经利用基因芯片技术检测正常组织中与癌组织中的基因表达差异，发现CD24在癌组织中的表达明显增高，通过免疫组化发现在90.7%的结直肠腺瘤和86.3%的结直肠腺癌表达CD24。CD24不光在直肠癌中高表达，CD24在卵巢肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝细胞癌、结肠癌、膀胱上皮细胞癌、胆管癌中是具有高表达的，充分说明了CD24在肿瘤的演进过程中的重要作用。

　　低表达CD24后抑制了SW620细胞对四种不同介质的粘附能力(collagenⅣ t=13.256,P<0.001;FN t=8.569,P<0.001;LN t=9.583, P<0.001;CollagenⅠ t=3.68,P<0.01)，但以LN为最明显，抑制率为58%，FN、CollagenⅣ、CollagenⅠ分别为31%,52%,11%.我们在研究中发现CD24对影响细胞对LN的黏附尤其明显。LN是一种广泛存在于基底膜的糖蛋白，被认为是调节细胞黏附、游走、极化、铺展、分化和诱导神经纤维生长等行为的重要成分。Mr900ku由3条肽链构成，A链Mr400ku，B1和B2链各Mr220ku。3条链的基因分别位于不同染色体，B1、B2、A链基因分别位于7号、1号、18号染色体。在钙离子的存在下，LN可以通过短臂末端球域自动聚合或直接与Ⅳ胶原结合。CD24对LN的黏附调节明显，是否暗示了它可以调节由LN引发的一系列的下游信号，细胞黏附LN主要是靠整合素β1来介导的，这给我们提示了整合素β1可能是CD24的作用下游。

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[临床医学] 抑制CD24表达对SW620细胞粘附能力影响的研究