Ki67蛋白在人皮肤血管瘤组织中的表达及意义

jz066520 · 发表于 2014-6-2 10:29:21

【摘要】  目的：探讨Ki67蛋白在人皮肤血管瘤组织中的表达及在血管瘤发生、发展过程中的意义。方法：应用免疫组织化学方法检测了血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤组织中Ki67蛋白的表达水平, 采用HPIAS1000图文报告管理系统对Ki67蛋白的表达进行定量分析，并用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果：Ki67蛋白在增生期血管瘤内皮细胞呈高表达,退化期呈低表达，增生期血管瘤内皮细胞与退化期比较, Ki67蛋白的表达差异有显著性(P<0.05);退化期血管瘤内皮细胞Ki67蛋白表达水平与正常组织相比，差异无显著性(P>0.01)。结论：Ki67可作为评价细胞增殖状态的一个指标。

【关键词】  皮肤血管瘤; Ki67蛋白; 免疫组织化学; 统计分析

血管瘤是婴幼儿中发病率最高的一种以内皮细胞异常增殖为组织学特征的肿瘤。新生儿患病率为1.1%～3.8%，至1岁时可高达10%。虽然部分血管瘤可以自行消退，但仍有部分未退化的血管瘤可持续发展或其生长部位特殊而具有一定的危险性，如果位于颜面、颅内及口腔可引起明显的畸形及功能障碍，如持续发展可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症;位于颜面及口腔的血管瘤可引起明显的外观畸形及功能障碍，严重影响患者的身心健康[1～3]。临床治疗尤其对于大面积血管瘤的治疗尚缺乏确切、迅速有效的方法。目前为止，关于血管瘤发生、发展及退化的机制尚未完全明了, 因此给血管瘤的诊断和治疗带来许多困难。我们试图寻找引起皮肤血管瘤持续发展和增生的相关因子和因素，为治疗血管瘤提供理论依据。

　　目前研究表明，肿瘤的发生发展与细胞凋亡抑制和增殖能力的增强密切相关。Ki67是一种与增殖细胞相关的核抗原,是近年来研究最多、最具有前途的细胞增生标记。其功能被认为与细胞的有丝分裂密切相关。研究发现Ki67抗原是一种表达于细胞的增殖期核抗原,是一种核内蛋白质,与细胞增殖有关,静止期细胞表达很少,因此可作为评价细胞增殖状态的一个指标[4～6]。

　　本研究通过应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤织中Ki67蛋白的表达水平，探讨Ki67蛋白在血管瘤增生过程中的作用机制，为临床上治疗血管瘤提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 材料来源收集武汉大学人民医院病理科及武汉大学人民整形外科2000～2007年皮肤血管瘤存档蜡块50例，其中男性26例，女性24例。所有切片经病理学专家诊断为血管瘤。这些血管瘤所在的部位有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性治疗。

　　1.1.2 材料分组常规HE染色，按Mulliken分类标准进行分组：增生期血管瘤27例，退化期血管瘤23例，另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作对照。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　1.2.1 主要试剂 ①即用型鼠抗人Ki67单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);②超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);③DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.2.2 主要仪器 ① YWY781型医用微波仪，250 W，50 Hz (浙江临安电子器材厂生产);② 家用高压锅;③ 电热恒温干燥箱 (湖北黄石医疗器械厂生产);④ 显微镜成像系统 (Olympus公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 蜡块切片厚5 μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规HE染色。

　　1.3.2 免疫组织化学SP法检测Ki67抗原具体步骤：① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;④ 正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应; ⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为阳性对照组。

　　1.3.3 免疫组织化学结果判断

　　Ki67蛋白阳性染色为棕黄色颗粒，主要定位于细胞核内。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

　　采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对Ki67蛋白的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ,测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。

　　1.4 统计学处理

　　数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5 软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。

　　2 结果

　　增生期血管瘤内皮细胞胞核内可见密集分布的棕黄色颗粒，Ki67蛋白呈阳性表达;退化期血管瘤内皮细胞胞核内可见少量的棕黄色颗粒，Ki67蛋白呈阴性表达;正常皮肤组织血管内皮细胞胞核内可见少量的棕黄色颗粒，Ki67蛋白表达呈弱阳性。图像分析结果显示: 增生期组Ki67蛋白表达的平均光密度为0.3671±0.0264, 退化期组Ki67蛋白表达的平均光密度为0.0973±0.0062, 正常皮肤组Ki67蛋白表达的平均光密度为0.1578±0.0112; 增生期组Ki67蛋白表达的阳性面积率为0.2983±0.0219, 退化期组Ki67蛋白表达的阳性面积率为0.0764±0.0069, 正常皮肤组Ki67蛋白表达的阳性面积率为0.1058±0.0120,经单因素分析增生期组与退化期组比较(P<0.05)，差异有显著性。退化期组与正常皮肤组比较(P>0.01)，差异无显著性。正常皮肤组与增生期组比较，(P<0.05)，差异有显著性。见表1。表1 血管瘤不同时期Ki67蛋白表达的平均光密度注：增生期组与退化期组比较，* P<0.05; 退化期组与正常皮肤组比较，△P>0.01; 正常皮肤组与增生期组比较，▲P<0.05。3 讨论

　　皮肤血管瘤(hemangioma)是婴幼儿较常见的一种良性血管肿瘤，也见于成人。虽然部分个体皮肤的血管瘤可以自行消退，但生长部位特殊以及部分未自行消退的血管瘤具有一定的危险性。如：持续发展的血管瘤可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症;而位于颜面部、颅内及口腔的血管瘤可引起明显的外观畸形及功能障碍;大面积及多发性血管瘤由于占据大量血流可导致高输出性心力衰竭，直接威胁患者的生命。皮肤血管瘤好发于头、面颈，次为四肢和躯干。发生率在新生儿为1.1%～2.6%，约有40%在出生时即可见到，时常在生后2～4周时快速生长。因此对这一部分血管瘤采取何种治疗手段是目前临床及基础研究较为关注的课题。

　　Ki67属于非组蛋白，对蛋白酶高度敏感，很难分离提取。它的测定是评估人类各种组织增殖组分的可靠和简单的方法，常用Ki67标记指数表示。Ki67抗原的量随细胞周期的不同而发生改变。在G1中期到后期出现表达，S期和G2期逐渐增加，有丝分裂期达到高峰。现认为Ki67的功能与染色质相连，与细胞的有丝分裂有关，它可能是具有结合特性重要结构蛋白，在有丝分裂中，起着维持DNA规则结构的重要作用。Ki67的研究多用于判断肿瘤的良、恶性及恶性程度，也用于探讨细胞增殖活性、细胞周期与肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为及预后的关系。Ki67抗原是应用最广泛的增殖细胞标记之一[7～10]。

　　Ki67是存在于细胞核中能影响细胞增殖的一种蛋白质,为细胞增殖及DNA合成所必需,是反映细胞增殖活性的一个良好的辅助指标。Ki67抗原在有丝分裂期的G1、S、G2期和M期均有合成,但在G0期缺失,由于半衰期短,可以准确的反映细胞的增殖活性,是一个较理想的反映肿瘤细胞增殖活性标志物,明显优于PCNA指数,DNA倍含量等表示细胞增殖的指标,细胞增殖活性的增高与肿瘤的发生发展及恶性程度有关,肿瘤恶性程度越高Ki67蛋白表达水平越高, 肿瘤细胞增殖越快,越易于发生侵袭、转移;故Ki67与肿瘤的预后密切相关[11～13]。Ki67在增殖细胞中表达的一种核抗原，基因定位于10号染色体上，其在维持细胞增殖活性中起重要作用闭，Ki67抗原在有丝分裂期的Gl、S、G2期核M期均有合成，而在G0期缺失，由于其半衰期较短，在反映细胞增殖活性方面，明显优于DNA倍含量、PCNA指数等表示细胞增殖的指标[14～16]。

　　细胞的无限增殖是肿瘤的显著特征之一，检测肿瘤细胞的增殖状态对协助诊断、估计预后及指导治疗都具有重要意义。本实验结果显示：增生期组与退化期组比较(P<0.05)，差异有显著性。退化期组与正常皮肤组比较(P>0.01)，差异无显著性。正常皮肤组与增生期组比较，(P<0.05)，差异有显著性。Ki67在增生期血管瘤内皮细胞的表达明显高于退化期血管瘤内皮细胞和正常皮肤组织血管内皮细胞(P<0.05)，Ki67的高表达反映了增生期血管瘤极高的增殖活性，是血管瘤的特征性表现，可作为鉴别增生期的理想指标。Ki67蛋白是存在于细胞核中的一种重要的抑癌基因,为细胞增殖及DNA合成所必需,能较好地反映细胞增殖活性。细胞增殖活性的增高与肿瘤的发生发展及恶性程度密切相关。

　　Ki67作为细胞周期相关抗原,在疾病特别是肿瘤的研究中有广阔的应用前景,使我们对血管瘤的认识更加深入。仍有不少问题需要探讨:Ki67确切机制,Ki67在肿瘤发生、发展、转移的变化,与相关基因、细胞因子等在细胞增殖及疾病发展中的相互作用等,这些研究将使我们对肿瘤恶性行为的判断、指导治疗提供有力支持。

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