重组人促红细胞生成素对严重烫伤大鼠心肌细胞凋亡的影响

jz066520 · 发表于 2014-6-2 10:29:44

            作者：刘婷婷蒋成孙梦奎周乾毅

【摘要】  目的: 研究重组人促红细胞生成素对Ⅲ°烫伤大鼠心肌凋亡的保护作用。方法：采用Ⅲ°烫伤模型，大鼠随机分成烫伤组、对照组、EPO治疗组。大鼠烫伤后按每kg体重1%烫伤面积4 mL等渗盐水腹腔注射，并于伤后18 h处死动物。 HE染色及SP免疫组织化学染色观察心肌细胞组织结构改变和bcl2基因表达情况。结果: EPO治疗组大鼠心肌凋亡指数显著低于烫伤组(P<0.01)，bcl2蛋白表达也显著高于烫伤组(P<0.01)。结论: EPO对烫伤后大鼠心肌细胞凋亡有较好的抑制作用，其机制可能是EPO调控了凋亡相关基因bcl2的表达。

【关键词】  促红细胞生成素; 烫伤; 细胞凋亡; 心肌

近年来研究显示，严重烫伤可引起某些组织器官细胞凋亡，而细胞凋亡是导致烫伤后心功能障碍的一个重要因素，其因可能与氧自由基和Ca2+平衡失调等有关[1]，但详细机制尚不清楚。红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种重要的造血生长因子，是红细胞生成的重要调节剂[2]。近来研究发现，EPO 对离体成年大鼠心肌细胞和整体大鼠心肌缺血/再灌注损伤都显示保护作用，可使离体心肌细胞的凋亡减少15 %～30 %[3，4]。抑制烫伤后大鼠心肌细胞凋亡是保护心肌细胞的有效途径。EPO治疗心血管疾病虽有陆续报道，但目前有关EPO对烫伤后大鼠心肌细胞凋亡的保护作用研究尚未见报道[5]。

　　本研究旨在通过建立Ⅲ°烫伤大鼠动物模型，应用组织学及免疫组化探讨EPO对烫伤后大鼠心肌凋亡的保护作用，为临床治疗烫伤后的心脏衰竭寻找新的用药及治疗途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及动物

　　rHuEPO(华北制药厂生产，2ml/支，3000IU/ml);免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中山生物技术有限公司);其他常规试剂均为国产分析纯级。SD大鼠由武汉科技大学实验动物中心提供，体重200±20g，雌雄不限。

　　1.2 动物模型制备及实验分组

　　选健康SD大鼠60只，随机分成烫伤组、对照组、EPO治疗组，每组动物20只。

　　①烫伤组：按文献方法造成30%总体表面积(total body surface area，TBSA) Ⅲ°烫伤[6]。以25%乌拉坦 (5ml/kg 体重)腹腔内注射麻醉，10%硫化钠脱毛，24 h后于92℃水浴18 S，造成30%TBSAm度烫伤(经病理切片证实)。烫伤后按每公斤体重1%烧伤面积4 mL等渗盐水腹腔注射，大鼠分笼喂养，自由进食、饮水，并于伤后18 h处死动物，取心肌组织进行有关分析。②对照组：与烫伤组一样麻醉、脱毛，1 h后处死动物，做有关分析。③EPO治疗组：在伤后立刻腹腔注射EPO，剂量为5000IU/kg，其余操作与烫伤组相同。

　　1.3 心肌组织的常规病理形态学观察

　　常规石蜡包埋心肌组织，于心肌中部沿心脏轴线每隔1 mm连续切取3张5μm的切片，常规HE染色，光学显微放大镜下观察[7]。

　　1.4 心肌细胞凋亡检测及半定量分析

　　心肌组织按常规石蜡包埋，每个标本取3个不同部位切片，采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT酶)介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞，苏木素复染。在光镜下，正常细胞的细胞核呈蓝色，而凋亡细胞核则呈深浅不一的棕褐色。每张切片取5个阳性细胞视野，测定阳性染色面积率(视野中阳性核总面积与所有细胞核总面积的百分比)及阳性染色平均吸光度。计算细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)：AI(%)=阳性染色平均吸光度×阳性染色面积率×100[8，9]。

　　1.5 Bcl2检测及半定量分析

　　取心肌连续切片5张，按SP法进行免疫组化及显色，用CMIAS8型图像分析系统检测心肌细胞阳性染色面积和平均吸光度值，两者乘积为积分吸光度。每张切片于阳性表达区选择5个无重叠视野，求出平均积分吸光度值，用积分吸光度大小表达蛋白水平的高低。

　　1.6 统计学处理

　　采用SPSS 10.0统计软件进行分析，所有资料以均数±标准差(±s)表示，均数间差异采用方差分析, 显著性水准为0.05。2 实验结果

　　2.1 心肌组织形态学观察及心肌凋亡的检测

　　HE染色发现凋亡心肌细胞核核膜皱缩，染色质凝聚、趋边，在核膜下聚集呈斑块状;部分核仁消失，偶见胞核固缩。肌原纤维模糊、排列紊乱、部分溶解，以闰盘两侧为重。与对照组比较，烫伤组大鼠在烫伤18h后的心肌细胞调亡有发生，而对照组很少有凋亡细胞，烫伤组心肌凋亡细胞数明显高于对照组。EPO治疗组与对照组之间比较有明显的差异(P<0.05)，EPO治疗组心肌细胞凋亡数显著性的低于烫伤组(P<0.01)，表明EPO对烫伤后心肌细胞凋亡有较好的拮抗作用，半定量分析结果见表1。表1 EPO对 Ⅲ°烫伤大鼠心肌细胞凋亡指数的影响注：*与烫伤组比较,P<0.01，△与对照组比较P<0.05。

　　2.2 rHuEPO对心肌细胞Bcl2表达的影响

　　EPO治疗组中Bcl2蛋白的表达显著高于对照组和烫伤组(P<0.01)，半定量分析结果见表2。表2 EPO对大鼠心肌bcl2基因表达的影响注：*与烫伤组比较，P<0.05。

　　3 讨论

　　心肌细胞是一种终末细胞，在遭受伤害致死后不能再生，因此其存活对心脏功能具有重要意义。机体严重烫伤后出现的多器官功能衰竭往往以心泵输出量减少为直接诱引，心功能衰竭的发生机制一直是困扰研究者的难题之一。细胞凋亡是一种在基因调控不进行的主动有序的生理死亡过程，但细胞凋亡在烫伤后的心脏功能障碍中的病理生理意义目前尚未被阐明，研究显示，细胞凋亡也参与了烫伤后心肌损害，心肌细胞凋亡是引起烫伤后心功能障碍的重要原因之一。本研究显示，大鼠30%TBAS Ⅲ°烫伤后18h心肌细胞凋亡明显增多，烫伤组心肌细胞调亡数明显高于对照组，EPO治疗组心肌细胞凋亡数低于烫伤组，EPO治疗组心肌Bcl2 蛋白的表达显著高于烫伤组，而Bcl2基因家族在抗细胞凋亡过程中起着重要作用。由此提示，rHuEPO对烫伤后心肌细胞凋亡有抑制作用。

【参考文献】
  　1 张家平，黄跃生，周新.严重烧伤大鼠心肌细胞凋亡与心功能损害的关系.中华烧伤杂志，2002，18(5)：272～274.

　　2 吴歆华，吴宗贵.促红细胞生成素的心血管作用.上海医学，2004,27(4)：275～277.

　　3 Fiordaliso F , Chimenti S , Staszewsky L , et al. A nonerythropoietic derivation of erythropoietin protects the myocardium from the ischemic reperfusion injury . Proc Natl Acad Sci USA，2005,102 :2046～2051.

　　4 Peter van der Meer , Adriaan AV, Eril Lipsic, et al. Erythropoietin in cardiovascular diseases. Eur Heart J,2004,25 : 285～291.

　　5 刘欣，康毅.促红细胞生成素治疗心血管疾病的研究进展.中国心血管杂志，2005 ,10 (3 ):23～24.

　　6 万福生，李国辉，曾红.牛磺酸对烫伤大鼠血浆及心肌组织中肿瘤坏死因子和血管紧张素Ⅱ含量的影响.江西医学院学报，2003，43(3)：1～3.

　　7 张西联，黄跃生，党永明，等.生脉注射液对大鼠烧伤后心肌细胞凋亡的影响.中国心血管杂志，2007,29(2):12～13.

　　8 龚文华，万福生，李国辉，牛磺酸对烧伤大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制.中国病理生理杂志,2006,4(3):65～67.

　　9 刘丽乔，章洁，杨晓红，等.川芎嗪对严重烧伤大鼠心肌细胞凋亡的影响.江西医学院学报，2007,47(5):45～49.

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