人参皂苷Rg1对抗脑缺血再灌注大鼠脑组织FAS、FASL蛋白表达的定量分析

jz066520 · 发表于 2014-6-2 10:31:15

【摘要】  目的：探讨人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注大鼠脑组织FAS、FASL表达的影响。方法：取健康雄性SD大鼠30只。将其随机分为假手术组，模型组，人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组，阳性药物对照组，每组5只。采用线栓法制作大脑中动脉栓塞模型。于MCAO术后6小时，采用免疫印迹法对CA1 区的FAS、FASL蛋白表达情况进行定量检测。结果：模型组大鼠大脑右侧海马CA1区FAS、FASL含量最高;假手术组FAS、FASL含量最低;Rg1 20、40 mg/kg组的FAS、FASL蛋白含量显著降低，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，其中Rg1 40 mg/kg组FAS、FASL蛋白含量最低。结论：人参皂苷Rg1防治大鼠脑缺血再灌注损伤的机制可能与抑制脑组织FAS、FASL表达有关，且以高剂量效果较好。

【关键词】  人参皂苷Rg1; 脑缺血再灌注; FAS;FASL; 免疫印迹

免疫印迹技术(Western blot)是目前科研中较常用的蛋白定量检测方法之一，该法具有灵敏、高效等特点。本实验拟采用Western blot法对脑缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion，CIR)后大鼠海马CA1 区神经细胞FAS、FASL的表达进行定量检测，并观察人参皂苷Rg1 对FAS、FASL蛋白表达的影响，以明确人参皂苷Rg1 是否通过调控FAS、FASL蛋白的表达来抑制CIR损伤后的神经细胞凋亡。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　取健康雄性SD大鼠，饲养7天后随机分为 6 组：① 假手术组;② 模型组;③ Rg1 10 mg/kg组;④ Rg1 20 mg/kg组;⑤ Rg1 40 mg/kg组;⑥ 阳性药物对照组;每组 5 只大鼠。③～⑤组分别于术前 5天至取材当日连续腹腔注射人参皂苷 Rg1;⑥组注射尼莫地平注射液，①、②组分别注射 1.5 ml等渗生理盐水，均为 1 次/d。

　　1.2 主要实验药品

　　人参皂苷Rg1(纯度>95%)，吉林大学有机化学教研室;尼莫地平注射液，山西亚宝药业，批号071001;兔抗鼠FAS、FASL (Ser63)单克隆抗体，SANTA CRUZ公司;Marker预染蛋白质分子量标准、BCA 、NBT/BCIP、PMSF，碧云天生物技术研究所;其余试剂由辽宁医学院科学实验中心提供。

　　1.3 大鼠右侧局灶性脑缺血模型的制备

　　10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，模型制作采用改良线栓法[1]。线栓采用头端光滑烫圆的直径0.23mm鱼线，由右侧颈总动脉分叉部缓慢向颈内动脉颅内方向插入约(18.5±0.5)mm，使线头通过大脑中动脉起始处，阻断大脑中动脉的血流;假手术组插入深度<15 mm。阻塞后2 h，将尼龙线轻轻拔出行再灌注，再灌注时间为22 h。

　　1.4 免疫印迹检测及强度分析

　　MCAO术后24h,取各组大鼠5只，迅速断头取出右侧海马置于液氮冷冻,-80℃冰箱保存。取冷冻脑组织,加入RIPA裂解液,剪碎、超声波粉碎20s后静置30min, 4℃,12 000r/min 离心20min,留取上清液。用二喹啉甲酸法测定蛋白含量,并按照每20μl含50μg蛋白制成样品， -20℃冰箱保存。按实验室常规上样、电泳、转膜后,5%小牛血清白蛋白室温封闭1～2h。加入一抗(兔抗大鼠FAS、FAS-L,稀释度为1∶400)4℃孵育过夜,TBST缓冲液洗脱3次,每次5min;二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体,稀释度为1∶200)室温孵育1h,TBST缓冲液洗脱3次, 每次5min; BCIP/ NBT显色;扫描电泳条带,用凝胶分析软件分析电泳条带强度。采用βActin作为内参照。扫描电泳条带,用凝胶分析软件分析各蛋白目的条带的吸光度。根据目的条带与内参照条带吸光度的比值表示待测蛋白含量。

　　1.5 统计学分析

　　数据分析应用SPSS10.0软件，所有数据均用±s表示。多组间差异显著性检验采用单因素方差分析。

　　2 结果

　　免疫印迹结果显示，模型组大鼠大脑右侧海马CA1区FAS、FASL含量最高;假手术组FAS、FASL含量最低;Rg1 20、40 mg/kg组和阳性药物对照组大鼠海马CA1区的FAS、FASL蛋白含量显著降低，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，其中Rg1 40 mg/kg组FAS、FASL蛋白含量最低;Rg1 10 mg/kg组与阳性药物对照组比较有显著性差异(P<0.05)，而Rg1 20、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P>0.05)。见表1，图1。表1 各组大鼠MCAO术后24 h海马CA1区FAS、FASL蛋白表达含量比较注：与假手术组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05;与阳性药物对照组比较，△P<0.05;与Rg1 10 mg/kg组比较， ▲P<0.05;与Rg1 20 mg/kg组比较，★P<0.05。

　　(A假手术组，B模型组，C Rg1 10 mg/kg组，D Rg1 20 mg/kg组，E Rg1 40 mg/kg组，F阳性药物对照组)

　　图1 各组大鼠MCAO术后24h海马CA1区FAS、FASL蛋白含量电泳条带　3 讨论

　　FAS蛋白，又称为Apo1和CD95，属于TNFR家族，是一种跨膜蛋白，是一种具有重要功能的细胞表面受体、促凋亡基因，它与FAS配体(FASL)结合可以启动caspase级联反应，直接导致细胞凋亡，这一途径称为死亡受体介导的凋亡途径[2。FAS广泛表达于机体各种细胞的表面，也广泛分布于皮质与海马的神经细胞及神经胶质细胞。Frigerio等[3]发现CIR可诱导小胶质细胞FASL 的过度表达，并通过FASL途径介导细胞凋亡。郝久宽等[4]采用TUNEL和免疫组化方法观察细胞凋亡及Fas蛋白在CIR后随时间延长动态变化情况，研究发现CIR后神经细胞凋亡增加，并且过度地表达Fas，以缺血半暗带明显。研究表明，缺血状态如果得不到及时的纠正和控制，缺血半暗带的神经细胞通过细胞凋亡的形式而成为永久性梗死灶的一部分。因此，干预细胞凋亡过程，挽救缺血半暗带的濒临死亡的神经细胞，控制缺血半暗带向梗死区的发展是防治CIR损伤的关键之一。

　　人参皂苷Rg1 是从人参中提取的有效成分之一，其主要靶器官是中枢神经系统[5，6]。现代医学研究表明，人参皂苷Rg1 具有抑制帕金森病(Parkinson's Disease，PD)模型等神经细胞凋亡的作用。陈滢等[7]采用TUNEL法检测，发现人参皂苷Rg1预处理对1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶诱导的小鼠黑质神经元凋亡(模拟PD模型)有明显的抑制作用;陈晓春等[8]采用流式细胞技术等方法检测多巴胺诱导的PC12细胞凋亡状态(模拟PD模型)，发现预先经过人参皂苷Rg1处理的PC12细胞，其细胞的凋亡率和NO代谢产物NO2水平以及半胱天冬酶3活性均有显著的下降，并且发现不同浓度的人参皂苷Rg1对细胞凋亡的抑制效果不同，其中以浓度高组对多巴胺诱导的PC12细胞凋亡的抑制效果更为明显。但人参皂苷Rg1是否能通过死亡受体途径来调控CIR神经细胞凋亡，还有待于进一步验证。

　　本实验结果显示，MCAO术后24h，假手术组FAS、FASL阳性表达较少见;模型组阳性细胞显著增多，此结果提示神经细胞凋亡数量增加，这一实验结果与以往文献报道基本一致;与模型组比较，人参皂苷Rg1各治疗组FAS、FASL则显著减少，此结果提示神经细胞凋亡数量减少;人参皂苷Rg1各治疗组分别与阳性药物对照组比较，Rg1 20、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异，其中Rg1 40 mg/kg组效果优于Rg1 20 mg/kg组，而Rg1 10 mg/kg组FAS、FASL的表达虽然得到一定程度的抑制，但与阳性药物对照组比较仍有显著性差异(P<0.05)，提示人参皂苷Rg1在抑制神经细胞凋亡方面存在剂量-效应关系，即在一定范围内，随着药物剂量的增加，抑制神经细胞凋亡的效果也更为明显。本实验结果证实了不同剂量的人参皂苷Rg1 可以通过下调死亡受体途径的凋亡相关基因(FAS、FASL)的表达从而抑制神经细胞凋亡，进一步发挥其对CIR损伤的保护作用，且存在剂量效应关系。

【参考文献】
  　1 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke.1989,20(1):84～91.

　　2 Becher B,Barker PA,Owens T,et al.CD95CD95L: can the brain learn from the immune system? Trends Neurosci,1998,21(3):114～117.

　　3 Frigerio S, Silei V, Ciusani E et al. Modulation of FasLigan(FasL) on human mincroglial cells: a in vitro study.J NeuroimmunoSuppl，2000, 26,105(2):109～114.

　　4 郝久宽，于维东，白抚生，等.大鼠局灶性脑缺血再灌注后Fas表达与细胞凋亡关系的研究 . 脑与神经疾病杂志，2001,9(5):272～273.

　　5 Xu L, Liu LX, Chen WF. Effect and mechanism on dopamine contents of striatum in rat model of Parkinson's disease ginsenoside Rg1. China Journal of Chinese Materia Medica,2008,33(15):1856～1859.

　　6 Wang J, Xu HM, Yang HD,et al. Rg1 reduces nigral iron levels of MPTPtreated C57BL6 mice by regulating certain iron transport proteins. Neurochem Int,2009,54(1):43～48.

　　7 陈滢,陈晓春.Bcl2家族是人参皂甙Rg1抗黑质神经元凋亡的重要调控蛋白.解剖学报,人2002,33(5):496～499.

　　8 陈晓春,朱理安,黄春.人参皂甙Rg1对多巴胺诱导PC12细胞凋亡的保护作用.中药药理与临床,2000,16(2):13～15.

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