MT1MMP在大肠癌中的表达及统计分析

jz066520 · 发表于 2014-6-2 16:23:01

【摘要】  目的: 探讨膜型基质金属蛋白酶1(membrane type 1 matrixmetallo proteinase ，MT1MMP)在大肠癌中的表达及统计分析。方法: 收集武汉大学人民医院病理科2004～2009年有完整临床和病理资料的大肠癌存档蜡块40例和5例癌旁组织，采用免疫组织化学SP法检测40例大肠癌和5例癌旁组织中MT1MMP的表达水平。采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统，对MT1MMP的表达进行定量分析，并用SPSS11. 5 软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果：MT1MMP在大肠癌中呈高表达，癌旁组织中呈低表达。大肠癌与癌旁组织相比，差异有显著性(P<0.05 )。结论：MT1MMP可能通过降解ECM参与肿瘤的侵袭和转移，检测MT1MMP的表达有助于预测肿瘤的转移,为治疗肿瘤提供了新的靶点。

【关键词】  大肠癌; MT1MMP; 免疫组织化学; 统计分析

　近年来,随着人们生活水平的改善和生活习惯的改变,大肠癌的发病率在逐年增加。已由恶性肿瘤的第4位上升到第3位,发达国家如美国估计大肠癌死亡人数56290人,占全年癌症死亡总数的9.9%,仅次于肺而位居第2位[1]。但其发病机制尚不明确，目前认为是一个多步骤、多阶段及多基因参与的遗传性疾病。

　　MT1MMPs最重要的作用是激活MMP2降解ECM成份，包括各种胶原、蛋白多糖和糖蛋白等，它们在许多生理、病理过程如胚胎发育、伤口愈合、血管形成、风湿性关节炎、纤维化等以及肿瘤的浸润和转移等过程中发挥着重要的作用[2，3]。

　　本研究采用免疫组化和图像分析方法检测和分析了膜型基质金属蛋白酶1在大肠癌中的表达，为治疗肿瘤提供了新的靶点。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　收集武汉大学人民医院病理科2004～2009年大肠癌存档蜡块40例(均经病理学证实为大肠癌)，其中男性20例，女性20例，平均年龄55.9岁,另取5例癌旁组织做对照。

　　1.2 方法

　　1.2.1 HE染色常规取材、固定、脱水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

　　1.2.2 免疫组织化学SP法检测MT1MMP相关抗原具体步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应;苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为MT1MMP的阳性对照组。

　　1.2.3 免疫组织化学结果判断

　　MT1MMP以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

　　采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对MT1MMP的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ,测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

　　1.3 统计学处理

　　对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和q 检验，检验水准α为0.05。

　　2 结果

　　2.1 MT1MMP的表达

　　大肠癌细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒, MT1MMP呈强阳性表达;癌旁组织细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，MT1MMP表达弱。图像分析结果显示：大肠癌MT1MMP的平均光密度为1.4728±0.0146;癌旁组织MT1MMP的平均光密度为0.5374±0.0095。大肠癌MT1MMP的阳性面积率为1.6577±0.0159;癌旁组织MT1MMP的阳性面积率为0.6410±0.0087。经q 检验，大肠癌与癌旁组织之间，MT1MMP的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P<0.05) 。见表1。表1 大肠癌和癌旁组织MT1MMP表达的平均光密度和阳性面积率注：* 大肠癌与癌旁组织比较，P<0.05。

　　3 讨论

　　大肠癌是最常见的消化系恶性肿瘤之一,虽然临床上对其可采取综合性的治疗措施,但其发病率和死亡率仍居恶性肿瘤的前列,且呈逐年上升的趋势[4]。肿瘤的侵袭、转移仍是大肠癌患者死亡的主要原因[5]。大肠癌的发生是一个复杂的多步骤过程,包括肠上皮细胞增殖、分化、凋亡及幸存机制的进行性紊乱。

　　1994年，日本癌症研究所Sato等[6]从人胚胎cDNA文库中筛选出一种新基因，长3.4 kb，编码一种新的582个氨基酸，分子量为66 kDa，因其分布在细胞膜上，故命名为膜型基质金属蛋白酶(membranetype matrixmetalloproteinase，MTMMP)。基质金属蛋白酶(MMPS)是一组锌离子依赖性内肤酶，在正常组织中广泛表达，涉及组织重建、骨重建和塑型、怀孕和分娩、乳腺组织退化、组织浸润等重要的生理功能，在病理过程如风湿性关节炎、牙周炎、肾小球肾炎、冠心病等也有重要作用，尤其与肿瘤细胞侵袭、转移相关的细胞外基质降解和肿瘤新生血管形成密切相关[7～9]。　　MT1MMP作为MMPs家族中的一员，其蛋白质结构具有MMPs家族的基本结构：前肽区、信号肽区、催化区、铰链区和类血红素蛋白结合区五个功能区域，能够在细胞表面活化基质金属蛋白酶2(proMMP2)。另一方面，MT1MMP在促进血管新生(angiogenesis)中也发挥着重要的作用[10]。实体肿瘤不仅通过肿瘤血管从宿主获得丰富的营养，而且还通过肿瘤血管向宿主输出大量的恶性肿瘤细胞，导致肿瘤持续生长并发生浸润及远处转移。临床与动物实验都证明，如果没有新生血管形成来供应营养，肿瘤在达到1～2 mm的直径或厚度(约107个细胞)后将不再增大。因此诱导血管生成的能力是恶性肿瘤能生长、浸润与转移的前提之一[11，12]。

　　大多MMPS是以可溶性酶原形式存在，但MMPS也可通过I型跨膜区、GP工或11型跨膜区与细胞膜相连，即以膜型形式存在。MTIMMP是膜型MMP的典型成员，与细胞的多种生理、病理过程相关[13]。己经证明MTMMPs可以在肿瘤发生侵袭前将由肿瘤细胞或周围基质细胞产生的MMP2招募至肿瘤细胞膜表面。还发现MTIMMP可以在转录水平调节血管内皮细胞生长因子的表达，从而促进肿瘤新生血管形成。可见MTIMMP在肿瘤细胞侵袭活动中起主要作用[14，15]。

　　从我们的实验结果发现:大肠癌组织中MT1MMP的表达较癌旁组织明显增高,大肠癌与癌旁组织MT1MMP的平均光密度和阳性面积率比较有显著性差异(P<0.05),这些结果提示: MT1MMP的高表达是恶性肿瘤的表现之一，MT1MMP前蛋白肽的C末端具有特定的氨基酸序列(RXKR)，若该序列被相关蛋白酶切割，则能诱导MT1MMP活化，提示MT1MMP可能在转录后水平进行，我们认为MT1MMP蛋白在大肠癌的表达增强是大肠癌生物学行为的重要影响因素。研究MT1MMP在大肠癌中的表达及统计分析将有助于了解大肠癌的发病机制,为大肠癌的基因治疗和药物治疗提供参考依据。

【参考文献】
  　　1 JemalA,MurrayT,Ward E,et al.Can cer stafstics,2005.CACancer Jclin, 2005，55:10～15.

　　2 Malemud CJ.Matrix metalloproteinases(MMPs)in health and disease:an overview.Front Biosci,2006,11:1696～1701.

　　3 Watanabe N,Ikeda U.Matrix metalloproteinases and atherosclerosis.Curr Atheroscler,2004,REP6:112～120.

　　4 Kim JC,Kim SY,Roh SA,et al.Gene expression profiling:canonical molecular changes and clinicopathological features in sporadic colorectal cancers.World J Gastroenterol，2008，14:6662～6672.

　　5 施凉潘,潘运龙.结直肠癌血管形成、侵袭和转移的研究进展.世界华人消化杂志，2008，16:62～67.

　　6 Sato H,Takino Y,Okada Y,et al.A matrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumor cells.Nature,1994,370(6484):61～65.

　　7 Harada T,Axii S,Mise M,et al.Membranetype matrix metalloproteinase1 (MTlMMP)gene is overexpressed in highly invasive hepatocellular carcinomas.J Hepatol,1998,28(2):231～239.

　　8 Kayano K,Shimada T,Shinimiya T,et al.Activation of proMMP2 mediated by MT1MMP in human salivary gland carcinomas:possible regulation of proMMP2 activation by TIMP2.J Patho1,2004,202(4):403～411.

　　9 Yamamura EI,Strongin AY.Upregulation of vascular endothelial growth factor by membranetype 1 matrix metalloproteinase stimulates human glioma xenograft growth and angionesis.Cancer Res,2002,62(2)：580～588.

　　10 Sood AK,Fletcher MS,Cofin JE,et al.Function role of matrix metalloproteinase in ovarian tumor cell plasticity.Am J Obstet Gyneol,2004,190(4):899～909.

　　11 Chun TH,Saben F,Ota I,et al.MT1MMPdependent neovessel formation within the confines of the threedimensional extracellular matrix.J Biol Chem, 2004, 167 (4):757～767.

　　12 Koshikawa N,Minegishi T,Sharabi A,et al.Membranetype metalloproteinase1(MT1MMP)is a processing enzyme for human lamin gamma 2 chain.J Biol Chem, 2005, 280(1):88～93.

　　13 Kondo S,Kubota S,Shimo T,et al.Connective tissue growth factor increased by hypoxia may initiate angiogenesis in collaboration with matrix metalloproteinase.Carcinogendis,2002,23(5):769～776.

　　14 Sounni NE,Devy L,Hahiton A,et al.MTIMMP expression promotes tumor growth and angiogenesis through an upregulation of vascular endothelial growth factor expression.FASEB J,2002,16(6):555～564.

　　15 Oh J,Takahashi R,Adachi E,et al.Mutation in two matrix metalloproteinase genes,MMP2 and MT1MMP,are synthetic lethalincreased in mice. Oncogene, 2004, 23(29):5041～5048.

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