胸水标本满足双向电泳的样本前期处理与制备

jz066520 · 发表于 2014-6-2 16:27:24

【摘要】  目的：建立胸水标本满足双向电泳的样本前期制备方法。方法：采用离心去除细胞成分、去除高丰度白蛋白和IgG、丙酮沉淀去除杂质等前期处理的方法以满足双向电泳的条件。结果：蛋白质的回收率为14.55%;处理前, 240μg的胸水蛋白上样量在双向电泳图中可检出(412±24) 个蛋白质点, 处理后240μg的胸水蛋白上样量可检出(552±20) 个蛋白质点。经上述胸水前期处理后得到的双向凝胶电泳图谱更加清晰，检出蛋白质点增加，分辨率提高。结论：成功建立了胸水前期处理满足双向电泳条件的方法，已建立的胸水蛋白双向凝胶电泳技术将为进一步的胸水蛋白质成分研究奠定基础。

【关键词】  胸水; 样品制备; 双向电泳; 蛋白质组学

　　蛋白质组学的发展为体液的研究提供了很好的技术平台, 涉及血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液等体液的蛋白质组学研究正蓬勃发展[1]。体液蛋白质分析对于研究疾病的发病机理、疾病诊断、癌细胞转移及治疗都有重要意义。体液蛋白质为了适合进行双向电泳分析，也需要做适当处理，除去电泳的干扰物质才能获得准确的和重复性好的结果。对于体液总蛋白的分离存在的主要问题在于蛋白质丰度的巨大动态范围和蛋白质在相对分子质量(Mr) 、等电点( pI) 方面的多样性。本试验重点探讨胸水蛋白质的前期处理方法，试图建立稳定的胸水蛋白质分离技术，为进一步的胸水蛋白质成分研究奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本

　　胸水标本取自南方医院病理科。

　　1.2 试剂

　　硫脲、尿素、二硫苏糖醇( DTT) 、碘乙酰胺、甘氨酸、CHAPS、甘油均为Sigma 公司产品;固相IPG干胶条(pH 3～10NL, 17 cm) 、IEF buffer ( pH3～10)、覆盖液、2D Quant kit、Aurum Serum Protein Mini Kit 均购自Biorad公司; 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、SDS、丙酮、硝酸银、甲醛和乙醇、硫代硫酸钠、碳酸钠等为国产分析纯。

　　1.3 仪器

　　IPGphor 等电聚焦仪(Protean IEF cell) 、垂直电泳系统(protean Ⅱ xi cell)购自Biorad公司、Imagescanner 扫描仪( Amersham Biosciences 公司) 、ImageMaster图形分析软件，低温离心机(Beckman公司)。

　　1.4 样本制备

　　1.4.1 离心去除细胞离体胸水收集后立即4℃，4000转/分，离心10分钟，去除细胞成分。收集上清，分装-20℃冻存。

　　1.4.2 高丰度白蛋白和IgG的去除按照Aurum Serum Protein Mini Kit的操作说明，用180μL binding buffer稀释60μL胸水，加至column孵育15分钟，收集已去除白蛋白和IgG的过滤液。

　　1.4.3 丙酮沉淀去除杂质已去除白蛋白和IgG的过滤液加入4倍体积的预冷丙酮，置-20℃4小时，取出后4℃13 000转/分，离心10分钟。弃去上清，再加入少许预冷丙酮冲洗沉淀，4℃13 000转/分，离心10分钟，弃去上清。重复一次。收集沉淀，室温风干。置-20℃冻存。

　　1.5 蛋白定量

　　采用2D Quant kit，分别测定未做处理的胸水和已去除白蛋白和IgG并进行丙酮沉淀的胸水浓度。

　　1.6 双向电泳

　　1.6.1 被动水化分别取240μg未处理的胸水和已去除白蛋白和IgG并进行丙酮沉淀的胸水与水化上样液(7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS,65mMDTT,1%IEF buffer,0.001%溴酚蓝)混合，总体积350μL，混匀，均匀加入泡胀槽, 撕开干胶条的保护膜, 胶面朝下覆盖在混合液上, 1 h后用2～3 ml 矿物油覆盖胶条, 置室温水化14 h。

　　1.6.2 第一向等点聚焦设置聚焦参数：150 V 3 h、慢速, 250 V 1.5 h、慢速,500 V 1 h、慢速, 1000 V 1 h、慢速, 5000 V 3 h、快速, 10 000 V 至60 000VH、快速。

　　1.6.3 平衡等电聚焦电泳结束后, IPG 胶条立即在平衡液A 中缓慢摇荡平衡15 min, 再在平衡液B中缓慢摇荡平衡15 min。

　　1.6.4 第二向SDSPAGE 电泳: 配置13%SDSPAGE凝胶，12mA/胶30 min, 24 mA/胶电泳至溴酚蓝线达胶底。

　　1.7 凝胶染色

　　按文献[2]方法进行硝酸银染色。

　　1.8 凝胶图像分析

　　用Imagescanner透射扫描仪扫描凝胶, ImageMaster 软件分析比较扫描图谱。　2 结果

　　2.1 回收率

　　表1 经处理后胸水蛋白质的回收率

　　2.2 样本处理前后图谱比较

　　图1未进行处理的样本图谱中，由于高丰度白蛋白和IgG的掩盖，背景深，白蛋白及IgG重链、轻链区蛋白成片，模糊不清，可检出蛋白点较少(412±24个);图2样本经去除高丰度白蛋白和IgG并进行丙酮沉淀处理后，图谱中检出蛋白点明显增多(552±20个)，分辨率提高。

　　3 讨论

　　由于体液成分复杂，各种干扰因素多,上样前期处理方法效果欠佳,而致体液的蛋白质组学与同期组织细胞的蛋白质组学研究比起来,发展缓慢,明显滞后。而蛋白质的样品制备是蛋白质组研究的第一步,无论后续采用怎样的分离或鉴定手段,样品制备都是关键步骤[3～5]。

　　胸水与血浆相似,不同的蛋白含量可以相差108～1012 个数量级以上,含有大量的白蛋白、球蛋白等高丰度蛋白,白蛋白含量最多,达35～40mg/mL,占总蛋白含量的50%～70%，IgG占总蛋白含量的10%～25%。而许多低丰度蛋白含量极微, 为pg级。而正是一些种类繁多、性质各异的低丰度蛋白和相对分子质量较小的蛋白,能带给我们十分重要的信息。然而，利用2DE 方法分离血清蛋白质时,高丰度蛋白的存在会掩盖许多重要的低丰度蛋白,使其不能被分离出来,而且,IPG 干胶条的上样量是一定的,高丰度蛋白量多了,也就相对减少了低丰度蛋白的上样量, 降低了低丰度蛋白的分离效果[6],这也是现有的2DE 方法分离血清蛋白质的缺陷,成为目前这一研究领域的瓶颈。

　　本试验应用BIORAD公司的去白蛋白和IgG试剂盒去除高丰度白蛋白和gG, 效果较好, 240μg上样量图谱中, 去除白蛋白和IgG以后使一些被白蛋白和IgG遮掩的蛋白质点显现出来。图1中未去除白蛋白和IgG，白蛋白、球蛋白的轻链及其重链区背景较浓, 该区域的蛋白质点分离效果欠佳。图2去除白蛋白和IgG后，大部分白蛋白被去除，一些被白蛋白和IgG遮掩的蛋白质点显现出来。处理前前蛋白质点为(412±24)个, 而处理后蛋白质点达到(552±20)个, 蛋白质点明显增多, 大多数蛋白质点能够清楚可辨, 胸水蛋白质双向电泳图谱质量得到改善。

　　丙酮沉淀可去除胸水中的脂类、盐分及经去除高丰度蛋白步骤所结合的杂质等。浓度为55μg/μL的60μL胸水经上述操作，可得到480μg的蛋白，足够两次上样量，蛋白质回收率为14.55%。

　　侯伟健[7]等人用未处理的胸水标本进行双向电泳，pH3～10，13cm，500μg的上样量检出蛋白质点300个左右。本试验应用pH3～10NL，17cm，240μg的上样量,未处理的胸水标本检出(412±24) 个，检出率有所提高。

　　目前对于体液蛋白质组学的研究方兴未艾, 血浆或血清蛋白质组学研究较多, 胸水蛋白质组学国内外报道很少, 而胸水成分虽然与血浆相似, 但是由于局限于胸腔的病变有其自身的特点, 所以与血浆成分应还有较多的差别, 胸水蛋白质组学的研究将深化对胸腔内疾病的认识。本研究采用去细胞成分、去除白蛋白和IgG、脱脂、脱盐等胸水前期处理, 摸索胸水样品制备方法, 对胸水蛋白质双向电泳进行探索, 得到了与血浆蛋白质组学相似的图谱, 重复性好, 初步建立了胸水蛋白质组学双向电泳技术, 为进一步的胸水蛋白质组学研究打下了基础。

【参考文献】
  　1 王学红，卢放根，张洪，等.腹水前期处理满足双向凝胶电泳技术的探索.中国医学工程, 2007,15(3):235～238.

　　2 Mortz E, Krogh TN, Vorum H, et al. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrisassisted laser desorption/ionizationtime of flight analysis. Proteomics, 2001, 11: 359～1363.

　　3 Angelika Gorg, Walter Weiss, Michael J. Dunn.Current twodimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics, 2004, 4: 3665～3685.

　　4 Margaret M Shaw, Beat M Riederen. Sample preparation for twodimensional gel electrophoresis. Proteomics, 2003,3: 1408～1417.

　　5 Link AJ. Internal Standards for 2D. Methods Mol Biol, 1999, 112: 281～284.

　　6 Wang YY, Cheng P, Chan DW. A simple affinity spin tube filter method for removing highabundant common proteins or enriching lowabundant biomarkers for serum proteomic analysis. Proteomics, 2003, 3: 243～248.

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