法医病理学皮肤切片制作的方法与探讨

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               作者：孟晓萍 唐志佼 袁玉林

【摘要】  目的：鉴于法医病理学皮肤病理制作难的特点，从而摸索皮肤组织制片的新方法与新思路。方法：采用软化剂固定液处理, 延长脱水时间与浸蜡时间、进行石蜡切片、HE染色。结果: 经软化固定液处后的皮肤组织结构完整、厚薄均匀、组织细胞结构清晰的皮肤组织切片，为法医学病理诊断及法医学判案提供了有力的证据。

【关键词】  法医病理; 皮肤组织制片; 软化固定液

组织病理制片是法医病理鉴定人用作病理鉴定的基本和重要依据之一,只有高质量的病理切片,才能为迅速、准确诊断提供必要条件[1]。而皮肤组织制片质量的优劣，直接影响组织学观察、检验和诊断结果，特别是对于病理学诊断和法医病理学鉴定至关重要[2]。由于皮肤组织是人体最大的器官，皮肤组织大致分为表皮、真皮、皮下组织、皮肤附属器等复杂结构，层次多、层与层之间的致密度有所不同，角质层相对更致密，皮肤组织中纤维成分亦特别丰富而致密[1]。而法医病理学的皮肤组织比较特殊，多数大部分尸体组织死后解剖时间为>48h,即不能得到及时固定或是制片前已经过10%福尔马林固定过的皮肤组织;其次电灼伤死亡的皮肤组织经灼伤后皮肤层次破坏较大，组织分离、断裂、碎屑较多，切片过厚等缺陷[3]，这样给皮肤制片带来相当的难度。针对上述特点，本研究通过50例电灼伤死亡皮肤组织的制片的过程，为提高皮肤切片及染色质量进行了摸索与实践。积累工作经验，获得了电击烧灼死亡等皮肤的病理切片的制作方法与体会。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　收集武汉大学法医门诊尸体解剖皮肤组织50例，进行石蜡切片、HE染色。

　　1.2 试剂配制

　　Bouin氏液:75%苦味酸(饱和);25%甲醛;5ml冰醋酸。

　　1.3 试验步骤

　　① 每例组织进行皮肤软化固定24小时;　② 70%酒精+适量浓氨水去黄2小时;③ 流水冲洗30分钟;　④ 70%酒精4小时;　⑤ 80%酒精4小时;　⑥ 95%酒精(1)+95%酒精(2)各4小时;　⑦ 100%酒精(1)+100%酒精(2)各2小时;　⑧ TO透明剂(1)半小时+ TO透明剂(2)过夜;　⑨ 浸蜡I54～56℃、II56～58℃、III60～62℃各1.5小时(烤箱温度63℃);⑩ 常规包埋切片染色。

　　2 结果

　　经采用Bouin氏液固定液固定、延长脱水时间、延长浸蜡时间等制片处理后，组织切片厚薄均匀而完整、无褶皱、组织结构清晰;表皮层、角质层、颗粒层结构完整、细胞层次分明，确保了组织细胞形态的完整性;细胞着色适度、胞核、胞浆染色对比度清晰可见，得到了比较满意的效果。见图1、2。

　　3 讨论

　　不同的固定剂直接关系到组织切片的成败与质量高低,从而影响实验结果,因此对固定剂的选择是获得良好组织切片化学染色结果的关键性条件之一[3]。针对皮肤常规制片中易出现的组织细胞形态结构不完整、切片厚度不一、破碎、重叠、皱折、染色不均和过染等特点，首先应该选择适宜法医病理学皮肤病理制片的固定剂。由于皮肤组织细胞层次多，结构致密，纤维及脂肪细胞丰富且质地坚硬，导致固定液较难渗透到组织深部，从而造成组织固定不佳，蜡块及组织过硬、细胞脆性增大、切片厚度增加、染色效果不良等重要因素。另外，由于法医病理组织一般解剖时间大多在48小时以后，所以不能满足新鲜组织及时固定;其中电灼伤死亡的皮肤，皮肤层次破坏、纤维萎缩、核固缩、细胞核皱缩扭曲及组织坚硬，是难以制作优质石蜡切片的[3]。所以改善组织固定至关重要，Buoin固定剂中的苦味酸对肌腱黏蛋白有溶化作用，它还有较强的渗透力，对组织固定均匀且收缩小，对皮肤又有软化作用[4]。对组织进行软化处理，降低组织的硬度，减少切片的阻力，以保持组织切片的完整性。所以我们选择Buoin软化固定剂固定皮肤组织24～48小时。图1 腰部灼伤死亡皮肤, Bouin氏液固定处理，图2 腰部灼伤死亡皮肤, Bouin氏液固定处理,H.E染色 ×20 H.E染色 ×10使用软化固定剂固定后的组织，一定要用70%酒精加以适量的浓氨水来进行除苦味酸的去黄处理，而不要用流水直接冲洗，因为流水直接冲洗会破坏组织的结构，造成细胞膨胀、紊乱等现象[4]。　脱水是影响切片质量的重要因素。皮肤组织脱水的时间要充分的掌握，脱水时为避免组织过度收缩，应从低浓度逐步至高浓度将组织内的水分逐步置换出来。脱水必须彻底，造成切片组织块凹陷、切片不完整，影响染色效果。所以既要保证脱水彻底又要保证不过度脱水[5]，皮肤组织脱水的时间为20小时。由于皮肤组织结构致密并含有脂肪，组织不易渗透，如果组织浸蜡时间过长，易造成组织块分离，蜡块内产生气泡、裂隙、破碎等。反之，蜡液不易渗透到组织深部，组织块硬度不均匀，造成切片厚薄不一，影响切片质量及染色效果。实验结果验证，浸蜡温度选择逐渐递增，54～62℃温度下适当的延长浸蜡时间4～4.5小时的效果较好。有的标本因患者死亡时间过长，细胞开始死亡，细胞核碎裂、溶解，因此苏木素染色时间须延长，深染色多分化[6]。

　　总之，法医病理学的皮肤组织切片的制作从标本的取材到切片完成，每个操作步骤都非常很关键，稍有不慎就会造成组织切片层次不完整、重叠、染色不均和厚度不等现象[4]，直接影响法医学结果的诊断与鉴定结论。我们要不断总结经验，不断探索与实践，制作出高质量的病理切片，为司法鉴定提供高质量服务。

【参考文献】
  　1 钟白玉,唐书谦,郝飞,等. 皮肤病理切片制作特点与质量控制.实用皮肤学杂志,2008,1(2)：73～75.

　　2 吕俊耀,于晓军, 刘卯阳.常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法.法医学杂志,2008,24(1):51～53.

　　3 王海萍.电灼伤死亡患者皮肤病理切片的制作.现代实用医学，2009,21(3):269～270.

　　4 王珏,汤显斌, 刘涛.皮肤切片制作时组织标本的处理方法.山西医科大学学报， 2007,38(5):451.

　　5 石岩.皮肤病理切片制作过程中的几点体会.新疆医学,2008,38:98.