皱皮木瓜总黄酮对胃肠平滑肌的松弛作用及其机制分析

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【摘要】  目的探讨皱皮木瓜总黄酮(FLC)对胃肠平滑肌的松弛作用及其相关机制。方法采用家兔离体空肠、回肠和胃底平滑肌生物测定法, 观察FLC对空肠自主性收缩和Ach诱导收缩的影响, 以及回肠和胃底对不同激动剂（Ach和 CaCl2）的反应。结果FLC对空肠自主性收缩和Ach诱导收缩反应均呈抑制作用; 剂量依赖性抑制Ca2+诱导回肠收缩（P﹤0.01）及Ach 所致胃底肌条的收缩，非竞争性拮抗Ach和CaCl2累积量效曲线, 压低最大反应。结论 FLC松弛胃肠平滑肌与阻断VDC减少外钙内流和内钙释放作用有关, 但与M胆碱受体阻断无关。

【关键词】  皱皮木瓜总黄酮 胃肠平滑肌 机制分析

　　Abstract:ObjectiveTo elucidate the relaxant effects and related mechanisms of total flavone from Chaenomeles lagenaria Koidz(FLC) on relaxant gastrointestinal smooth muscles. MethodsThe relaxant effects and related mechanism of FLC were studied on the contraction of isolated rabbit jejunum, ileum and gastric fundus agonized by Ach and CaCl2. Results FLC inhibited the contraction of isolated jejunal autonomic and jejunum agonized by Ach. In the isolated rabbit gastric fundus or ileum, FLC were found to inhibit the contraction induced by Ach and CaCl2 in dose-dependent manner, and non-competitively antagonize the Ach or CaCl2 cumulative dose-response curves with a lower maximal response, while Atr(atropine) competitively inhibited the gastric fundus contraction induced by Ach.ConclusionThe mechanisms of relaxant gastrointestinal smooth muscle of FLC is related to its blocking effect on the voltage dependent Ca2+channel （VDC）, but is not related to muscarinic receptor blocking.

　　Key words:FLC;   Gastrointestinal smooth muscle;   Mechanism analysis
   
　　皱皮木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles lagenaria ( Loisel) Koidz的果实，主产于我国安徽，湖北和四川等地, 其中的主要成分包括有机酸、黄酮类和皂苷等。针对皱皮木瓜的临床应用基础，我室曾对其乙醇提取物进行过整体动物研究。实验表明：皱皮木瓜乙醇粗提物具有松弛胃肠平滑肌和镇痛作用［1，2］，为了探讨其中的有效部位和深入的药效机制，本实验利用皱皮木瓜总黄酮对胃肠平滑肌的松弛机制进行了分析和探讨。

　　1  材料和方法

　　1.1 材料  健康家兔，雌雄兼用，体重2.0～3.0 kg, 由三峡大学实验动物中心提供。皱皮木瓜取自湖北长阳资丘，由三峡大学天然药物重点实验室汪鋆植教授鉴定。皱皮木瓜总黄酮（FLC）由三峡大学化生学院提供，制备过程参照文献［3］以ADS-17大孔树脂纯化即得FLC，临用时用双蒸水配制相应浓度备用。氯化乙酰胆碱（Acetylcholine chloride， Ach）, 上海试剂三厂产品。维拉帕米（Verapamil, Ver）购自天津药业集团公司。硫酸阿托品注射液（Atropine, Atr）购自武汉远大药业集团公司。ADS-17大孔树脂，南开大学化工厂。其他试剂均为市售分析纯。实验用Standard Tyrode液(mmol/L)：NaCl 136.9,  KCl 2.68,  CaCl2 1.80,  MgCl2 1.05, NaH2PO4 0.42，Glucose 5.55。无钙Tyrode液中不加钙而另加0.1 mmol/L EDTA，使之成为含EDTA的无钙液。无钙高钾Tyrode液除无钙外，KCl改为40 mmol/L，替代等mmol/L的NaCl。PowerLab离体器官灌流仪（澳大利亚）。

　　1.2  方法取禁食24 h家兔, 击头致昏后, 迅速剪取与十二指肠相连的空肠约2.0 cm和距回盲部约3 cm的回肠1.5～2.0 cm, 用Tyrode液反复冲洗肠腔内容物备用; 同时取胃底全层肌标本约2 cm×2 cm, Tyrode液冲洗干净后, 按Vane氏法制备胃底肌条。受试标本分别置于含10 ml的Tyrode液(37±0.5)℃的浴槽中, pH 7.2～7.4, 标本一端连于张力换能器, 另一端固定, 标本张力负荷1 g, 实验过程中持续通入95%O2+5%CO2混合气体, 标本张力变化通过张力换能器记录于PowerLab离体器官灌流仪。实验所用药物浓度均按浴液终浓度计算。
   
　　统计学处理：数据以±s表示, 应用SPSS10.0软件, 组间比较用t检验；作图采用SigmaPlot2001软件。

　　2  结果

　　2.1  FLC对家兔空肠自主性收缩和Ach诱导收缩的影响空肠在Tyrode液平衡30 min后，产生规律而衡定的自主性收缩，加入0.01 mmol/L Ach后收缩频率与正常无异，但张力增加约30%，然后分别加入0.2%,0.4%和0.8% FLC，记录在不同实验条件下空肠收缩频率和张力的变化，观察10 min。结果见表1。

　　2.2   FLC对CaCl2诱导回肠平滑肌收缩的影响实验方法和条件同2.1项，标本温育后换无钙Tyode液，可见回肠自主性收缩逐渐减弱，当收缩频率和张力明显受抑制后，加入CaCl2 2.0 mmol/L, 可见回肠收缩作用迅速恢复，记录收缩幅度和张力的变化，用无钙Tyode液冲洗标本3次，分别加入0.2%，0.4%和0.8%的FLC，5 min后同法加入CaCl2 2.0 mmol/L，比较给药前后标本对CaCl2收缩作用的影响。结果见表2。

　　表1  FLC对家兔空肠自主性收缩和Ach诱导收缩的影响（略）

　　aP<0.05 vs给药前;bP<0.01 vs给药前，n=6
   
　　由表1可见，FLC无论是对空肠自主性收缩，还是Ach诱导收缩均剂量依赖性抑制其功能，对收缩频率与收缩张力相比，张力抑制更明显。

　　表2  FLC对CaCl2诱导家兔回肠平滑肌收缩的影响（略）

　　aP<0.05，vs Control group; bP<0.01；n=6
   
　　由表2可见，当加入不同浓度的FLC，再次复钙时，回肠的收缩张力明显减弱, 且具有剂量依赖性（P﹤0.01）, 0.8%FLC较对照组下降了75%。　2.3   FLC和Atr对Ach致家兔胃底肌条收缩的影响标本在Tyrode中平衡1h后，加入不同浓度的Ach可见胃底肌条产生迅速而短暂的收缩，得Ach累积浓度的量效曲线，用Tyrode液冲洗标本，待肌张力恢复至基线，分别加入0.2%，0.4%，0.8%的FLC和0.001 μmol/L Atr, 10 min后重测Ach量效曲线，结果0.4%，0.8%FLC使Ach量效曲线非平行右移，浓度依赖性压低Ach量效曲线，而Atr使Ach量效曲线呈典型的竞争性拮抗, 最大反应不压低。见图1。

　　图1  FLC和Atr对Ach致家兔胃底平滑肌收缩的影响（略）

　　2.4  FLC和Ver对CaCl2致家兔回肠收缩的影响回肠标本在无钙Tyrode液中平衡30 min，换无钙高钾液稳定30 min，建立CaCl2（累积浓度依次为0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10 mmol/L）量效曲线, 其他操作方法同“2.3”项。结果FLC和Ver均能浓度依赖性使CaCl2量效曲线非平行右移，压低最大反应，Ver的pD2′值为（7.21±0.31）。

　　3  讨论
   
　　皱皮木瓜为传统中药，应用历史悠久，具有多方面的药理作用，但其中的化学成分复杂，药理作用机制不清。根据以往的研究基础, 我们将其中的黄酮作为重点研究对象。植物中的黄酮类化合物具有广泛的药理作用，而植物来源不同又有差异，如银杏黄酮、葛根黄酮、水杉黄酮抗心律失常，预防和逆转心肌肥厚；黄芪和黄芩总黄酮具有保肝及免疫调节作用；甘草黄酮等具有抑制胃肠平滑肌功能等［4～9］。皱皮木瓜的胃肠解痉作用早已被中医临床所证实，然而其药理作用机制和有效成分并不清楚。胃肠平滑肌的运动受多种因素的调控，包括神经因素，体液因素和局部激素等,其中神经因素和体液因素是主要因素,然而无论是神经因素,还是体液因素引起胃肠平滑肌收缩, 最终均需要依赖胞内Ca2+介导，细胞内的Ca2+浓度的调节由细胞膜钙通道、细胞器钙摄取和释放、钙泵及Na+-Ca2＋交换系统参与。静息状态下, Ca2+不能自由通过功能正常的细胞膜。当细胞膜兴奋时, 膜特异的钙通道开放,细胞内Ca2+浓度升高, 同时触发细胞内细胞器钙库释放Ca2+, 胞浆内Ca2+升高达到一定水平(1～50 μmol/L)时, Ca2+与肌钙蛋白或肌调蛋白结合, 从而产生细胞收缩活动等。对于主要是依外钙而实现收缩(相对于骨骼肌)的胃肠平滑肌,一旦影响了外钙浓度或内流,即会明显影响其收缩活动。
   
　　实验中发现：FLC对复钙后的回肠标本呈浓度依赖性抑制；在无钙高钾Tyrode液中标本引起的收缩为高钾去极化，K+促使电压依赖性钙通道（VDC）开放，胞内细胞器钙库释放Ca2+所致， 经典的钙拮抗剂Ver可阻断这一通道，从而抑制心血管和胃肠功能等，FLC对Ca2+和高钾致肠平滑肌收缩均呈抑制作用，由此说明FLC具有与Ver相似的作用,特异性阻断VDC，减少外钙内流和内钙释放而松弛平滑肌。 在与阿托品的对照性实验中，可见FLC并非通过阻断M胆碱受体而松弛胃肠平滑肌。本实验研究为皱皮木瓜用于胃肠解痉提供了理论基础。

【参考文献】
  　　［1］ 杨兴海，柳 蔚，钱京萍． 资木瓜乙醇提取物对胃肠道平滑肌的实验研究［J］.四川中医，2004，22（3）：19.

　　［2］ 柳 蔚， 杨兴海，钱京萍．资木瓜乙醇提取物镇痛抗炎作用的实验研究［J］.四川中医，2004，22（8）：7.

　　［3］ 廖 亮. 银杏黄酮提取方法的研究［J］.食品科学，1994,8：33.

　　［4］ 耿秀芳, 李桂芝, 康 白, 等．银杏叶总黄酮对缩血管物质活性的影响［J］.潍坊医学院学报，2000，22(3)：192.

　　［5］ 刘 赛, 苏冬梅, 王春波,等． 葛根总黄酮对离体家兔主动脉平滑肌的作用［J］. 青岛医学院学报，1998，34(3):191.

　　［6］ 刘维莞, 杨晓茹, 屠治本, 等．水杉总黄酮抗实验性心肌肥厚及抑制心室c-Fos蛋白表达的作用［J］. 中草药，2001，32( 4)：329.

　　［7］ 程 虹, 刘惟莞, 陈 翔, 等．水杉总黄酮抗实验性心律失常的作用［J］.湖北医科大学学报，1999， 20(1)：28.

　　［8］ 汪德清,丁保国, 马艳青, 等．黄芪总黄酮对扑热息痛所致小鼠肝损伤防护作用的研究［J］.中国中药杂志，2001，26(7) ：483.

　　［9］ 贺海平, 秦 菁, 陈 明, 等．黄芩类黄酮对人免疫细胞化学发光及淋巴细胞增殖的影响［J］.中国免疫学杂志,2000,16(2)：84.