牡蛎糖胺聚糖对H2O2所致血管内皮细胞氧化损伤的保护作用

打盹的憨包子

   【摘要】 目的 了解牡蛎糖胺聚糖(OGAG)对过氧化氢所致血管内皮细胞(VECs)氧化损伤的保护作用及其机制。方法 采用人脐静脉内皮细胞株ECV304体外培养的方法，建立H2O2诱导的血管内皮细胞损伤模型，实验分为正常对照组、损伤模型组(过氧化氢50 mg/L)、肝素组(肝素200 mg/L，过氧化氢 50 mg/L)、OGAG保护组(OGAG 10、50、100、200、400、800 mg/L，过氧化氢 50 mg/L)、OGAG对照组(OGAG 100、200、400 mg/L)。采用噻唑蓝(MTT)比色法观察OGAG对血管内皮细胞增殖活性的影响,黄嘌呤氧化酶法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 与正常对照组相比，损伤模型组细胞的增殖活性和SOD的活活性均明显降低(F=137.23、135.40,q=5.26、 5.34，P<0.01),而OGAG对照组(100、200 mg/L)的细胞增殖活性明显增高(q=3.40、3.81,P<0.05)。与损伤模型组相比，OGAG各保护组(50～800 mg/L)细胞增殖活性明显增加(q=3.40～5.23,P<0.05、0.01)，SOD活性明显升高(q=4.46～5.07，P<0.01)。结论 OGAG对过氧化氢所致血管内皮细胞的氧化损伤具有保护作用，其作用机制可能与增加细胞内SOD活性有关。

　　【关键词】 牡蛎糖胺聚糖 内皮细胞 过氧化氢 超氧化物歧化酶

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo assess the protective effect of oyster glycosaminoglycan (OGAG) on the injury of vascular endothelial cells (VECs) induced by hydrogen peroxide and its corresponding mechanism.MethodsThe endothelial cell strain from human umbilical vein was cultured and a model of VECs injured by hydrogen peroxide (H2O2) was established. This study was conducted as follows: normal control group, OGAG control group (OGAG 100, 200, and 400 mg/L), H2O2injury group (H2O2 50 mg/L), heparin group(heparin 200 mg/L，H2O2 50 mg/L) and OGAG protective group(OGAG 10, 50, 100, 200, 400, and 800 mg/L，H2O2 50 mg/L). Influence of OGAG on proliferate activity of VECs was tested by means of MTT assay and levels of SOD were tested by xanthine oxidase. ResultsCompared with the normal control group, the proliferate activity of VECs of OGAG control group was significantly increased (q=3.40，P<0.05), while the proliferate activity of VECs and the levels of SOD of H2O2injury group were markedly decreased (F=137.23,135.40;q=5.26,5.34<0.01). Compared with OGAG control group, the proliferate activity of VECs and levels of SOD of the OGAG protective group were more significantly increased (q=3.40-5.11<0.05，0.01).ConclusionOGAG can protect the VECs from H2O2induced injury, and the possible mechanism may refer to the increasing of SOD activity in the injured VECs.

　　[KEY WORDS] oyster glycosaminoglycan; endothelial cells; hydrogen peroxide; superoxide dismutase

　　牡蛎(Oyster)俗称蛎黄、海蛎，是近海生长的一种双壳贝类动物，其不仅肉味鲜美，而且也是传统的中药材，具有滋阴养血、清热除湿、止心脾气痛等功效[`1]。牡蛎肉中含有丰富的糖原、蛋白质、氨基酸、微量元素及维生素等，其提取物具有抗菌、抗病毒、提高免疫力、调节血脂、抗动脉粥样硬化等作用[2]。近年来研究发现，血管内皮细胞的功能异常容易导致高血压、动脉粥样硬化等多种心血管疾病的发生。本文采用体外细胞培养的方法，通过建立过氧化氢诱导的血管内皮细胞(VECs)损伤模型，观察牡蛎糖胺聚糖(OGAG)对损伤VECs的保护作用。现将结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料及其来源

　　OGAG，青岛大学医学院药理学教研室提供; DMEM培养基，美国Hyclone 公司;胎牛血清，中国医学科学院生物工程研究所;胰酶，美国华美生物工程公司;肝素，上海生化制药厂;H2O2，山东高密制药厂;噻唑蓝，Sigma公司;二甲亚砜，Amresco公司;超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒，南京建成生物研究所;酶标仪，英国Tecan公司;721B型紫外线分光光度计，上海第三分析仪器厂;人脐静脉内皮细胞株ECV304，用DMEM含高糖培养基(含体积分数0.10胎牛血清)在含体积分数0.05 CO2的细胞培养箱中，37 ℃常规培养，实验采用传代细胞。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 实验分组 实验共分12组：正常对照组(1组)、损伤模型组(2组，过氧化氢 50 mg/L)、肝素组(3组，肝素200 mg/L，过氧化氢 50 mg/L)、OGAG保护组(4、5、6、7、8、9组，OGAG浓度分别为10、50、100、200、400、800 mg/L，过氧化氢 50 mg/L)、OGAG对照组(10、11、12组，OGAG浓度依次为100、200、400 mg/L)。

　　1.2.2 培养条件 将传代的VECs按108/L接种于96孔板，至汇合状态时, 换成无血清的DMEM培养基，同时肝素组、OGAG保护组和OGAG对照组分别加入相应浓度的药物给予处理，培养24 h后，损伤模型组、肝素组和OGAG保护组分别加入含H2O2(终浓度为50 mg/L)的培养基，12 h后终止培养。

　　1.2.3 细胞增殖活性测定 采用MTT法。细胞终止培养后加入MTT 20 μL,继续孵育4 h后，每孔加入200 μL的二甲亚砜，振摇，置于酶标仪测定570 nm处各孔吸光度(A)，分析细胞的增殖活性。

　　1.2.4 SOD活性的测定 采用黄嘌呤氧化酶法：黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈红色，分光光度计测其吸光度，计算被测样品中的SOD活性。

　　1.3 统计学处理

　　数据以±s表示,均数间比较采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 OGAG对氧化损伤的VECs增殖活性的影响

　　与正常对照组比较，损伤模型组VECs增殖活性明显降低(F=137.23,q=5.34,P<0.01)，OGAG对照组(100、200 mg/L)细胞增殖活性明显增强(q=3.46、 3.81,P<0.05)。与损伤模型组比较，OGAG保护组(50～800 mg/L)细胞增殖活性均有所增高(q=3.40～ 5.23,P<0.01、 0.01)，且随着OGAG浓度的增加，细胞增殖活性逐渐增强(图1、2)。

　　2.2 OGAG对氧化损伤的VECs的SOD活性的影响

　　正常对照组、损伤模型组、OGAG 50 mg/L保护组、OGAG 100 mg/L保护组、OGAG 200 mg/L保护组、肝素组SOD的活性分别为2.411±0.085、1.211±0.088、1.669±0.079、1.753±0.051、1.997±0.076、1.672±0.038 kU/L。与正常对照组比较，模型组细胞SOD的活性明显降低(F=135.40,q=5.26,P<0.01)。与损伤模型组比较,OGAG各浓度保护组(50、100、200 mg/L)随着浓度增高，SOD活性逐渐增强 (q=4.46～5.07，P<0.01)，OGAG浓度在200 mg/L时的作用最显著(q=3.70、3.03,P<0.05)，在50、100 mg/L 时，其作用效果与肝素相近(P>0.05)。