端粒酶和PCNA在胃癌组织中的表达意义

jz066520 · 发表于 2014-6-7 11:23:41

【摘要】  目的：研究胃癌组织中端粒酶和PCNA的蛋白表达及其临床病理学意义。方法：采用量子点免疫荧光组织化学方法检测胃癌组织芯片中端粒酶和PCNA蛋白的表达情况。结果：不同类型的胃癌，端粒酶和PCNA蛋白的表达具有差异，其中端粒酶在乳头和管状腺癌组与其他类型胃癌相比，差异具有显著性(χ2=5.675，P=0.017);III级组明显高于I～II级组，差异具有显著性(χ2=4.339，P=0.037);Ⅲ～Ⅳ期组显著高于Ⅰ～Ⅱ期组，且差异具有显著性(χ2=6.478，P=0.011);淋巴结转移组明显高于未转移组，且两组之间差异有极显著性(χ2=7.000，P=0.008)。PCNA表达Ⅲ-Ⅳ期组阳性显著高于Ⅰ～Ⅱ期组，且差异极显著性(χ2=7.729，P=0.005)，而且端粒酶和PCNA的表达呈显著正相关性(r=0.368, P=0.002)。结论：端粒酶和PCNA与胃癌的发生相关，且两者有协同作用。

【关键词】  胃癌; 端粒酶; PCNA; 量子点

胃癌是我国发病率和死亡率均居前位的恶性肿瘤，全世界约35%的病例发生在中国，每年我国死亡于胃癌的患者超过17万[1，2]。端粒酶与人类恶性肿瘤的发生和发展密切相关，它通过合成端粒DNA，阻止端粒消失，是细胞永生化而导致肿瘤的发生，是目前一种新的有望成为肿瘤早期诊断和治疗的标志物。细胞增殖核抗原(PCNA)作为调节细胞增殖的重要基因，有助于了解细胞的增殖活性，在胃癌的发生发展中起着重要作用。

　　量子点免疫荧光组织化学技术应用了量子点(quantum dots, QDs)的高敏感性，荧光强和不易猝灭等优势，能够更加准确的检测端粒酶和PCNA蛋白的表达情况，且量子点所发荧光能够完全与组织自发荧光区分开。

　　1 材料和方法

　　1.1 胃癌组织芯片资料统计

　　STC1501胃癌组织芯片购自桂林泛普生物技术有限公司，15×10点阵，每点直径约1.1mm，4μm厚，其中包括64例胃癌，6例淋巴瘤和间质瘤，5例正常及炎症等组织，双芯布阵。所有组织均来自临床外科切除标本，未进行放化疗治疗，经10%中性缓冲甲醛固定 24 h。胃癌患者中男性44例，女性20例，年龄24～83岁，平均58岁。按WHO胃癌组织学分类：乳头、管状腺癌共53例，其它类型如印戒细胞癌和未分化癌共11例;乳头、管状腺癌按病理分级：I～II级17例，III级36例;按TNM分期分类：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期32例;有淋巴结转移30例，未转移34例。

　　1.2 试剂

　　鼠抗人PCNA单克隆抗体、兔抗人端粒酶多克隆抗体、生物素化羊抗鼠、兔IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。605nm QDsSA(605nm量子点标记的链霉亲和素复合物)检测试剂盒购自武汉珈源量子点技术开发有限公司。

　　1.3 量子点免疫荧光组织化学检测端粒酶、PCNA蛋白的表达

　　实验方法参照文献进行。4μm厚胃癌组织芯片脱蜡、水化、微波抗原修复、TBS洗涤，封闭缓冲液 37 ℃湿盒孵育 30 min，滴加PCNA、端粒酶抗体，37 ℃ 孵育2 hr ，TBST漂洗5 min/次 ×3次，封闭缓冲液 37 ℃湿盒孵育 10 min，滴加生物素化羊抗鼠IgG(针对PCNA)或生物素化羊抗兔IgG(针对端粒酶)，37 ℃湿盒孵育 30 min，TBST 漂洗 5 min/次×3 次，封闭缓冲液 37 ℃湿盒孵育 20min，滴加用封闭缓冲液稀释的QDsSA，37 ℃湿盒孵育 30 min，TBST漂洗5 min/次 ×3次，滴加缓冲甘油封片剂封片。荧光显微镜下观察，端粒酶、PCNA蛋白的阳性信号均为红色，阳性面积≥25%时定义为蛋白的阳性表达。

　　2 结果

　　端粒酶的阳性部位主要定位于肿瘤细胞胞浆，分布均匀(见图1A)。胃癌患者中有38例端粒酶阳性表达，阳性率为59.4%，但在正常和炎症胃黏膜组织、印戒细胞癌均为阴性表达，两者之间比较，差异均有显著性(P<0.05)。端粒酶表达与胃癌临床病理参数的关系见表1所示，端粒酶的阳性表达率与胃癌患者的年龄和性别差异均无显著性(P>0.05)，但在乳头和管状腺癌组与其他类型胃癌相比，差异具有显著性(χ2=5.675，P=0.017);病理分级中III级明显高于I～II级，差异具有显著性(χ2=4.339，P=0.037);Ⅲ～Ⅳ期组显著高于Ⅰ～Ⅱ期组，且差异具有显著性(χ2=6.478，P=0.011);淋巴结转移组明显高于未转移组，且两组之间差异有显著性(χ2=7.000，P=0.008)。表1 端粒酶和PCNA的表达与胃癌临床病理因素的关系PCNA的阳性部位主要在癌细胞细胞核，呈颗粒状及片状分布(见图1B)。有46例胃癌患者PCNA呈阳性表达，阳性率为71.9%。胃癌临床病理参数的关系见表1，PCNA蛋白表达阳性率与胃癌患者的年龄、性别、不同病理类型、病理分级和淋巴结是否转移之间均无显著相关(P>0.05)，但TNM分期Ⅲ～Ⅳ期组显著高于Ⅰ～Ⅱ期组，且差异具有显著性(χ2=7.729，P=0.005)。端粒酶和PCNA在胃癌组织中有32例共同阳性表达，14例共同阴性表达，两者呈显著正相关(r=0.368, P=0.002)。A：端粒酶的表达(×200) B：PCNA的蛋白表达(×200)图1 胃癌中端粒酶和PCNA的蛋白表达　3 讨论

　　本研究发现胃癌组织中端粒酶表达阳性率高(阳性率为59.4%)，但在正常和炎症胃黏膜组织、印戒细胞癌均为阴性表达，两者之间比较差异均有显著性，表明端粒酶与胃癌的发生有关;端粒酶在乳头和管状腺癌组与其他类型胃癌组的表达，差异具有显著性，表明乳头和管状腺癌与其它类型相比有不同的生物学行为。在本研究中，端粒酶阳性在病理学III级组显著高于I-II级组，并且与高TNM分期和淋巴结转移均显著相关，提示端粒酶阳性有助于胃癌的进展。这均与国内外文献报道相近，如Yang等[4]发现胃癌与其他人体实体肿瘤一样其端粒酶阳性率较高;Matsutani等[5]观察癌组织端粒酶活性阳性率明显增高，由此证明端粒酶的表达与胃癌的临床病理参数和恶性程度密切相关，可作为临床诊断的重要标志物。

　　本研究显示，胃癌中PCNA阳性率为71.9%，显著高于正常和炎症胃黏膜组织，但与胃癌患者的年龄、性别、不同病理类型、病理分级和淋巴结是否转移差异均无显著性(P>0.05)，然而，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期组显著高于Ⅰ～Ⅱ期组，且差异具有显著性，表明PCNA与胃癌的发生密切相关。Cyzewska 等[6]等研究表明，肿瘤组织中PCNA的表达与组织不同病理类型之间具有非常密切的关系。此外，本研究中端粒酶和PCNA在胃癌组织中有36例共同阳性表达，14例共同阴性表达，二者呈显著正相关(r=0.368, P=0.002)，表明端粒酶和PCNA与胃癌的发生相关，且两者有协同作用。

　　综上所述，端粒酶和PCNA的表达呈正相关性，且与胃癌临床病理参数密切相关，因此结合PCNA的表达，端粒酶可作为胃肿瘤诊断的重要生物标志物。而且正常胃黏膜组织中并未检测到端粒酶的表达，也可作为区别正常及癌细胞的一个指标。

【参考文献】
  　　1 于志坚. 胃癌防治研究新进展. 交通医学, 2007, 21(3) :2251～2252.

　　2 王福生. 13427例胃癌临床资料分析.胃肠病学和肝病学杂志, 2006, 15 (1) : 402～411.

　　3 陈洪雷, 张玉霞, 夏东,等. 在组织芯片上利用量子点技术进行抗原的检测. 中华病理学杂志, 2008, 37(6): 416～417.

　　4 Yang SM, Fang DC, Luo YH, et al. Alterations of telomerase activity and terminal restriction fragment in gastric cancer and its premalignant lesions. J Gastroentrol Hepatol, 2001,16(8) : 876～882.

　　5 Matsutani N, Yokozaki H, TahBra E, et al. Expression of MREll complex (MRE11, RAD50, NBSI) and hrap1 and its relation with telomere regulation, telomerase activity in human gastric carcinomas. Pathobiology, 2001, 69: 219～221.

　　6 Czyzewska J, Guzińska-Ustymowicz K, Pryczynicz A , et al. Immunohistochemical evaluation of Ki-67, PCNA and MCM2 proteins proliferation index(PI) in advanced gastric cancer. Folia Histochem Cytobiol, 2009, 47(2):289～296.

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