魅优论文范文网

 找回密码
 立即注册
查看: 22231|回复: 0

[临床医学] 抗凋亡因子Survivin在肾性高血压心肌中的表达

[复制链接]

3609

主题

3609

帖子

1万

积分

论坛元老

Rank: 8Rank: 8

积分
10917
发表于 2014-6-7 11:24:27 | 显示全部楼层 |阅读模式
【摘要】  目的:探讨L精氨酸对肾性高血压心肌保护的作用机制。方法:将大鼠随机分为3组:正常对照组(5只)、高血压对照组(20只)及L精氨酸治疗组(20只), 制作肾性高血压动物模型, L精氨酸治疗组通过胃管灌饲给予L精氨酸,连续给药8周后,切取各组心室肌组织,进行免疫组织化学染色,观察各组心肌组织Survivin的表达。利用HPIAS2000图像分析系统测定Survivin在各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果:Survivin在LArg组的表达显著高于高血压对照组。图像分析结果显示Survivin在两组间差异有显著性意义(P<0.01)。结论:L精氨酸对肾性高血压导致的心肌细胞损伤具有重要的保护作用。
【关键词】  L精氨酸; Survivin; 心肌; 免疫组织化学

心血管疾病是当前威胁人类健康的头号杀手,心肌肥大是心脏病的独立危险因素,其详细机制尚不完全清楚。肾性高血压是继发于肾脏病的高血压,在原有疾病损害的基础上,血压升高会加重对心脏的损害[1]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年来发现的一种主要由内皮细胞等合成,释放的小分子生物活性介质,广泛参与机体多种病理生理过程。研究发现,作为体内NO合成的唯一底物Larg在多种组织或器官I/R损伤中发挥重要的保护作用[2]。深入研究LArg这一具有潜在重要前景的一氧化氮前体在治疗肺动脉高压中的作用与机制是当今该领域的重要课题。近年研究证实L精氨酸是一种新型抗高血压药物,但其作用机制尚不清楚。survivin 是新近发现的一种结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白( inhibition apoptosis protein , IAP ),表达于人与鼠的胚胎发育组织和人类大多数肿瘤组织, 但在正常成人组织不表达( 胸腺除外) [3],其与肿瘤发生、发展有关。survivin 还参与细胞周期调控[4]。我们应用免疫组织化学方法观察了L精氨酸对肾性高血压心肌组织中survivin的表达,并采用图像分析系统测定survivin表达的平均光密度和平均阳性面积率。探讨L精氨酸治疗由肾性高血压导致的心肌细胞的损害,为临床上采用L精氨酸治疗肾性高血压提供理论依据。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 实验动物 昆明种SD大鼠50只,雄性,体重180~200g ,武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1w后进行实验。

  1.2 方法

  1.2.1 动物模型建立及分组

  按体重将大鼠随机分为3组:正常对照组(5只)、肾性高血压组(20只)和L精氨酸治疗组(20只)。肾性高血压组和L精氨酸治疗组大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30mg/kg),然后动物取右侧卧位,暴露左肾区,在左肋弓下旁开脊柱0.5cm处作一切口,入腹腔探出左肾,分离左肾动脉,上一内径为0.20mm银夹,以部分缩窄左肾动脉。右侧肾脏不触及。然后,关闭创口,让大鼠苏醒。术前血压以100~140mmHg(1mmHg=0.1333kPa)为正常范围,术后血压超过140mmHg时,即确定动物高血压形成,并用于药物实验。对那些已放置银夹,但在术后第4周末血压仍未升高的大鼠,将在给药前从药物实验中剔除。LArg组于术后第5周开始每天给予L精氨酸200mg/kg;将L精氨酸溶于蒸馏水中通过胃管灌饲给药,连续给药8周。正常对照组给予同等容积的溶剂。在给药时间结束之时,再次测量动物体重和血压。8周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验观察。

  2.2 主要试剂

  ① 浓缩型兔抗鼠survivin单克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司);② 超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(北京中杉生物技术有限公司);③ 显色试盒及多聚赖氨酸(北京中杉生物技术有限公司)。

  2.3 免疫组织化学SP法检测survivin相关抗原

  主要步骤:① 组织切片5 μm,常规脱蜡至水,蒸馏水洗;② 3%过氧化氢,37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性,PBS洗4×5min;③ survivin采用微波抗原修复(3档,10 min), PBS洗4×5min;④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应;⑤ 一抗37℃孵育1h,PBS洗4×5min;⑥ 生物素标记的二抗,37℃孵育10 min,PBS洗4×5min;⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min,PBS洗4×5min;⑧ DAB显色液显色,自来水冲洗终止反应;⑨ 苏木精复染,脱水,透明,封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

  2.4 免疫组织化学结果判断

  survivin以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外,胞浆内无棕黄色反应物。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对survivin的表达进行定量分析,每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400),测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

  2.5 统计学处理

  对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验,检验水准α为0.05。

  2 结果

  正常对照组心肌细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒survivin呈阳性表达;肾性高血压组心肌细胞胞浆内棕黄色颗粒较少,survivin表达弱;L精氨酸治疗组心肌细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒,survivin呈阳性表达。肾性高血压组与L精氨酸治疗组之间survivin平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05),见表1。表1 正常对照组、肾性高血压组及L精氨酸治疗组survivin表达的平均光密度和阳性面积率3 讨论

  肾脏与高血压息息相关,从发生机制上看,可以说一切高血压的发生都有肾脏的参与,甚至是主要的参与因素。例如原发性高血压时肾素血管紧张素醛固酮对血压的调节;再如胰岛素抵抗综合征所致的高血压有肾小管对钠的再吸收增加的参与等。肾血管及肾实质性病变是继发性高血压最重要的原因,及时发现和治疗肾脏原发病是控制和根治高血压的关键,而控制高血压也是保护肾功能的重要措施之一。如何及时诊断和有效治疗是临床所关注的话题[5,6]。

  一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年来发现的一种主要由内皮细胞等合成,释放的小分子生物活性介质,广泛参与机体多种病理生理过程。研究发现,作为体内NO合成的唯一底物Larg在多种组织或器官I/R损伤中发挥重要的保护作用。深入研究LArg这一具有潜在重要前景的一氧化氮前体在治疗肺动脉高压中的作用与机制是当今该领域的重要课题。近年研究证实L-精氨酸是一种新型抗高血压药物,但其作用机制尚不清楚。L精氨酸降低血压和抑制主动脉肥厚的机制可能为:①增强血管内皮细胞NOS的活性[7~9],促进NO的合成与释放,通过NO扩张血管以改善血压和抑制血管平滑肌细胞增殖;②直接抑制血管平滑肌细胞增殖和血管壁间质胶原增生[10],改善血管重塑;③通过调节神经体液因素而调节血压和血管生长特性,如内皮素等。

  细胞凋亡是基因调控下的细胞自杀行为,对维持内环境的稳定具有至关重要的作用,在正常情况下凋亡可以消灭DNA受损的细胞,即有恶变潜能的细胞。而凋亡调控失调,可异常地延长细胞生存时间,促进有转化作用的突变积累,并协助细胞逃避免疫系统的监视作用而参与肿瘤的发生[11~13]。细胞凋亡过程受凋亡促进因子p53、Fas 等和凋亡抑制因子如bcl 、CAP 家族、Survivin 等的共同调节。研究表明,Survivin 是迄今发现最强的凋亡抑制因子。Survivin 以周期调节的方式表达于细胞周期的G2/M期,在有丝分裂早期,survivin 与有丝分裂纺锤体的微管有特异性的饱和反应,并受微管动力的调节。用微管抑制剂干预survivin 与微管之间的相互作用,可以导致survivin 抗凋亡活性的丧失以及caspase3 的激活,从而引起细胞凋亡[14~15]。survivin 部分地通过对纺锤体微管的作用调节细胞有丝分裂过程,进而发挥其抗凋亡活性。

  本研究表明:survivin在L精氨酸治疗组的表达高于肾性高血压组,差异有显著性(P<0.05)。表明Larg在肾性高血压导致的心肌细胞的损害中起了抑制细胞凋亡的重要保护作用,可能是Larg作为NO生成的同功酶,心血管系统内eNOS和iNOS活性、合成的变化直接影响到心血管疾病的发生发展。Survivin 在细胞生长分化中的作用,Survivin 的组织细胞选择性表达的分子机制, Survivin在肿瘤发生中是如何起作用的等等有待进一步研究探讨。

【参考文献】
   1 Ruilope LM, SalvettiA, Jamerson K, et al.Renal function and intensive

  lowering of blood pressure in hypertensive participants of the hypertension optimal treatment(HOT) study.JAm Soc Nephro, 2001, 12(2): 218~225.

  2 Martina V,Masha A,Gigliardi VR,et al. LongTerm NAcetylcysteine and LArginine administration reduces endothelialactivation and systolic blood pressure in hypertensive patientswith type 2 diabetesmellitus.DiabetesCare, 2008,2(11): 110~118.

  3 Das A, Tanw L, Teo J, et al. Expression of surviving in primary glioblastomas.Cancer Res Clin On col,2002,128(6):302~306.

  4 石全红,廖正步,支兴刚. 凋亡抑制基因survivin在脑膜瘤的表达及其与bcl2、bax的相关性. 第三军医大学学报,2007,29(3):253~255.

  5 Fukuda N.Development of gene therapies for cardiovascular and renaldiseases by nucleic acid medicines.Medicinal Chemistry,2006,2(1):13~19.

  6 Diskin CJ.Minoxidi use in proteinuric renal disease comment. ActaMedica Croatica,2008,62(1):93~98.

  7 Villalpando S, Gopal J, Balasubramanyam A, et al. In vivo arginine production and intravascular nitric oxide synthesis in hypotensive sepsis. Am J Clin Nutr,2006,84(1):197~203.

  8 Poon BY, Eko Raharjo,MSc,et al.Complexity of inducible nitric oxide synthase. Circulation, 2003,108(10): 108~110.

  9 尹时华,肖立新,化长林,等.L精氨酸对肾性高血压心肌肥厚大鼠血浆内皮素及左心室肌原癌基因cfos mRNA表达的影响.中国病理生理杂志,2001,17(6):542~547.

  10 王万铁, 郝卯林, 郁引飞,等.L精氨酸对肺缺血再灌注损伤时细胞凋亡的影响. 中国急救医学,2006,26(2):126~128.

  11 Muzio LL, Staibano S, Pannone G, et al. Expression of the apoptosis inhibitior survivin in aggressive squamous cell carcinoma.ExpMol Pathol, 2003,70:249~254.

  12 Okada E, Murai Y, Matsui K, et al. Survivin expression in tumour cell nuclei is predicative of a favorable prognosis in gastric cancer patients. Cancer Lett, 2003,163(1):109~116.

  13 Kennedy SM, Driscoll O, Purcell R, et al. Prognostic importance of survivin in breast cancer. Br J Cancer, 2003,88:1077~1083.

  14 Cohen C, Lohmann CM, Cotsonis G, et al. Survivin exp ression in ovarian carcinoma: Correlatione with apop totic marker and p rognosis. Mod Pathol, 2003,16 (6): 574~583.

  15 Grabowski P, Kuhnel T, Muhr W,kenshoff M, et al. Prognostic value of nuclear survivin expression in oesphageal squamous cell carcinoma. Br J Cancer, 2003,88(1):115~119.
回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

手机访问本页请
扫描左边二维码
         本网站声明
本网站所有内容为网友上传,若存在版权问题或是相关责任请联系站长!
站长电话:0898-66661599    站长联系QQ:7123767   
         站长微信:7123767
请扫描右边二维码
www.jtche.com

QQ|Archiver|手机版|小黑屋|魅优论文范文网 ( 琼ICP备10200388号-7 )

GMT+8, 2024-3-29 02:22 , Processed in 0.106033 second(s), 28 queries .

Powered by 校园招聘信息

© 2001-2020 魅优论文范文网校园招聘

快速回复 返回顶部 返回列表