改进的碱裂解法大规模提取质粒DNA

jz066520 · 发表于 2014-6-7 11:24:47

   作者：王勇袁华刘国磊袁玉林

【摘要】  对质粒的碱裂解小量提取法进行了改进，改进的方法克服了以往质粒提取方法的RNA等杂质污染、操作烦琐费时、一般条件下不能大规模提取等问题，该方法操作简单、经济、实用且大规模提取，提取的质粒DNA得率稳定、质量好，符合大多数分子生物学常规实验的要求。

【关键词】  纯化; 碱裂解; 质粒DNA

质粒的提取作为分子生物学领域的一项基本操作技术，几乎每天都要用到。尽管现在质粒提取的试剂盒有很多，但是对于普通的实验室，特别是科研经费不够充分以及实验条件不够好的实验室，并不能实现每次都用试剂盒来大规模提取质粒。所以，采用的还都是萨姆布鲁克[1]所提出的经典提取方法。本研究是在经典的质粒提取方法的基础上进行了一些改进，能够在简陋的实验室大规模提取质粒DNA，该方法还克服了以往提取质粒方法的RNA等杂质污染和操作烦琐，且得到的质粒DNA的质量和纯度均符合实验的要求。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 载体和菌株 Ecoli系DH5α宿主菌株由本室保存;重组质粒pGenesil1(5192bp.Ampr带有绿色荧光)和pGenesil3(4842bp.Ampr带有红色荧光)为靶向IGF1和EGF受体基因的小干扰RNA的真核表达重组质粒由本室设计和晶赛公司构建和鉴定。限制性内切酶EcoR I 为Promega 公司产品;Sal I为NEW ENGLAND BioLabsinc产品;其他常规分装分子生物学试剂均购于武汉天源生物技术公司。

　　1.1.2 主要试剂

　　氨苄青霉素与卡那霉素购自华美生物工程公司;其它各种堂规化学试剂均为分析纯。溶液Ⅰ：10mmol/L TrisHCl,pH7.5,50mmol/L EDTA, pH8.0;灭菌后，加入RNaseA至20ug/ml,4℃保存。溶液Ⅱ：1%SDS，0.2mol/L NaOH;现配现用，2%SDS，0.4mol/L NaOH母液等体积混均即可。溶液Ⅲ：与常规碱裂解法相同，1.32mol/L醋酸钾，pH 4.8,用醋酸调节pH值。灭菌后，4℃保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 质粒DNA的提取

　　常规提取方法主要按文献[1]进行，但提取得到的质粒DNA不用RNaseA消化。改进的质粒DNA大规模提取方法按如下步骤进行：① 挑单菌于带有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇菌过夜，至OD值为0.6，取1.5mL 菌液1.5mL ependorf管中，12000g,离心30s，弃尽上清，再重复两次，每个ependorf管共收集4.5mL菌;② 加入溶液Ⅰ600uL，漩涡振荡器振荡，振荡使菌体充分分散，室温放置5 min;③ 加入溶液Ⅱ600uL，轻轻颠倒ependorf管4～5次，使溶液充分混匀，置于冰上5 min;④ 加入溶液Ⅲ600uL，轻轻颠倒ependorf管4～5次，使溶液充分混匀，置于冰上15min;⑤ 12000g,4℃,离心15min;吸出上清，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻颠倒振荡，充分混匀;⑥ 12000g，室温，离心15min;弃尽上清，加入70%的乙醇洗涤沉淀一次;⑦ 超净工作台吹干沉淀或真空干燥，加入75uL无菌水，溶解沉淀。

　　1.2.2 质粒DNA的电泳检测采用琼脂糖凝胶电泳法[1]。制备1%琼脂糖凝胶，取2uL样品进行凝胶电泳检测。

　　1.2.3 质粒DNA的定量及杂质检测采用分光光度计(751GW)法[2]。样品释稀20倍后，分别测定OD260和OD280值，若OD260/OD280>1.8,表明DNA中含有RNA杂质。若OD260/OD280<1.6，表明样品中含有酚或蛋白质;OD260=0.1时，相当50ug/mL的DNA。

　　2 结果与分析

　　2.1 质粒DNA的电泳检测

　　实验中采用4842bp和5192bp的小质粒pGenesil1和pGenesil3的小质粒来检测改进的质粒提取方法的重复性和适用性。从图1可以看出，改进质粒提取方法的得率达到标准的常规方法，且质粒DNA质量好，主要以超螺旋形存在;质粒DNA杂质明显少于常规方法所提取的质粒;最主要的是在小提取质粒条件下，使用N个ependorf管可以一次性大规模提取质粒DNA;这种改进的方法同样可以适用大质粒的提取，并且得率比常规方法略高，解决了分子量大的质粒难以提取的难题。

　　2.2 质粒DNA的定量及杂质检测

　　采用常规与改进的碱裂解法提取的pGenecil1和pGenesil3质粒DNA，经分光光度计检测可知，改进方法提取质粒pGenecil1和pGenesil3的得率到达常规方法的水平，对于大质粒改进方法的得率更高，是常规方法的1.2倍。但是常规的碱裂解法提取未经RNaseA消化，质粒DNA的OD260/OD280比值明显增高者，表明RNA杂质明显减少(表1)。表1 不同方法所制备的质粒的质量及含量1: DNA Markers;2:来自随机1个菌落改进方法提取的pGenesil1;3～5:来自随机3个菌落改进方法提取的pGenesil3;6:来自随机1个菌落常规方法提取的pGenesil1;7～9:来自随机3个菌落常规方法提取的pGenesil3。图1 质粒DNA 的电泳检测

　　3 讨论

　　质粒大规模提取早期研究工作中的实验室水平和制备及设备工艺要求高大。本研究在经典的碱裂解小提取质粒的基础上进行了改进，使碱裂解菌液过程在N个ependorf管中完成。过去大多数质粒提取方法都是在最后的质粒DNA样品中加入RNaseA,以除去RNA杂质[3，4]，而本法直接将RNasA加入溶液Ⅰ中，在质粒的提取过程中进行RNA的消化，从而避免了常规方法在最后的质粒DNA中加入RNaseA,给样品带来人为蛋白污染;也保证了对所有样品裂解的均质性。从而使不同批次提取的质粒具有相同的质量。由于大肠杆菌不同菌株自身的特点，相同的提取方法提取的质粒会有所不同。不同的大肠杆菌细胞株会影响质粒的产量，也会影响质粒的质量或拓扑均一性，在细菌培养的过程中，由于Amp筛选压力的逐渐消失,不同菌株在保有质粒的性能上会有所差别，质粒会出现丢失现象。本实验中选择的挑单菌于带有Amp抗生素的LB液体培养基中，菌株在质粒保有率上是最好的，也比较适合碱裂解提取质粒的方法，从质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图1和OD260/OD280可以看出，在溶液Ⅰ预先加入RNaseA可以起到很好消化RNA杂质的作用，因而节省了RNaseA消化样品的时间，提高了提取效率。改进的方法还省去了苯酚和氯仿抽提过程。实验结果表明，所得样品纯度与常规方法所得样品纯度相近，节省了试剂与提取时间，整个提取过程不到1h。采用改进方法提取的质粒DNA干燥后，风干沉淀物有时可能产生不溶现象，依据我们经验，将沉淀物充分捣碎使其中DNA充分溶解，再离心，取上清。这不会造成质粒DNA的损失，也不会影响下游的实验。最重要是在小提取质粒条件下一次性可以大规模提取质粒DNA，达到了经济、简易、快速、效益和质量高的效果。

　　因此文中改进提取质粒的方法快捷、经济、实用。在我们的研究中，都是采用这种改进方法提取质粒DNA，其下游的内切酶消化、克隆、PCR、重组质粒测序鉴定、转化大肠杆菌和根瘤农杆菌等实验的结果和重复性都令人满意。

【参考文献】
  　　1J萨姆布鲁克, D W 拉塞尔. 分子克隆实验指南.黄培堂，译.北京：科学出版社, 2005.

　　2 F M 奥斯伯(美).精编分子生物学实验指南(第5版).北京：科学出版社, 2008.

　　3 义华，徐梅珍，于学平，等. 质粒DNA碱裂解提取法的改进. 江西农业大学学报(自然科学版),2002,24(6):851～53.

　　4 姚伟,周会, 徐景升, 等. 质粒DNA小量提取法的改进.应用与环境生物学报,2005，11(6)：776～778　2 结果与分析

　　2.1 质粒DNA的电泳检测

　　实验中采用4842bp和5192bp的小质粒pGenesil1和pGenesil3的小质粒来检测改进的质粒提取方法的重复性和适用性。从图1可以看出，改进质粒提取方法的得率达到标准的常规方法，且质粒DNA质量好，主要以超螺旋形存在;质粒DNA杂质明显少于常规方法所提取的质粒;最主要的是在小提取质粒条件下，使用N个ependorf管可以一次性大规模提取质粒DNA;这种改进的方法同样可以适用大质粒的提取，并且得率比常规方法略高，解决了分子量大的质粒难以提取的难题。

　　2.2 质粒DNA的定量及杂质检测

　　采用常规与改进的碱裂解法提取的pGenecil1和pGenesil3质粒DNA，经分光光度计检测可知，改进方法提取质粒pGenecil1和pGenesil3的得率到达常规方法的水平，对于大质粒改进方法的得率更高，是常规方法的1.2倍。但是常规的碱裂解法提取未经RNaseA消化，质粒DNA的OD260/OD280比值明显增高者，表明RNA杂质明显减少(表1)。表1 不同方法所制备的质粒的质量及含量1: DNA Markers;2:来自随机1个菌落改进方法提取的pGenesil1;3～5:来自随机3个菌落改进方法提取的pGenesil3;6:来自随机1个菌落常规方法提取的pGenesil1;7～9:来自随机3个菌落常规方法提取的pGenesil3。图1 质粒DNA 的电泳检测

　　3 讨论

　　质粒大规模提取早期研究工作中的实验室水平和制备及设备工艺要求高大。本研究在经典的碱裂解小提取质粒的基础上进行了改进，使碱裂解菌液过程在N个ependorf管中完成。过去大多数质粒提取方法都是在最后的质粒DNA样品中加入RNaseA,以除去RNA杂质[3，4]，而本法直接将RNasA加入溶液Ⅰ中，在质粒的提取过程中进行RNA的消化，从而避免了常规方法在最后的质粒DNA中加入RNaseA,给样品带来人为蛋白污染;也保证了对所有样品裂解的均质性。从而使不同批次提取的质粒具有相同的质量。由于大肠杆菌不同菌株自身的特点，相同的提取方法提取的质粒会有所不同。不同的大肠杆菌细胞株会影响质粒的产量，也会影响质粒的质量或拓扑均一性，在细菌培养的过程中，由于Amp筛选压力的逐渐消失,不同菌株在保有质粒的性能上会有所差别，质粒会出现丢失现象。本实验中选择的挑单菌于带有Amp抗生素的LB液体培养基中，菌株在质粒保有率上是最好的，也比较适合碱裂解提取质粒的方法，从质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图1和OD260/OD280可以看出，在溶液Ⅰ预先加入RNaseA可以起到很好消化RNA杂质的作用，因而节省了RNaseA消化样品的时间，提高了提取效率。改进的方法还省去了苯酚和氯仿抽提过程。实验结果表明，所得样品纯度与常规方法所得样品纯度相近，节省了试剂与提取时间，整个提取过程不到1h。采用改进方法提取的质粒DNA干燥后，风干沉淀物有时可能产生不溶现象，依据我们经验，将沉淀物充分捣碎使其中DNA充分溶解，再离心，取上清。这不会造成质粒DNA的损失，也不会影响下游的实验。最重要是在小提取质粒条件下一次性可以大规模提取质粒DNA，达到了经济、简易、快速、效益和质量高的效果。

　　因此文中改进提取质粒的方法快捷、经济、实用。在我们的研究中，都是采用这种改进方法提取质粒DNA，其下游的内切酶消化、克隆、PCR、重组质粒测序鉴定、转化大肠杆菌和根瘤农杆菌等实验的结果和重复性都令人满意。

【参考文献】
  　　1J萨姆布鲁克, D W 拉塞尔. 分子克隆实验指南.黄培堂，译.北京：科学出版社, 2005.

　　2 F M 奥斯伯(美).精编分子生物学实验指南(第5版).北京：科学出版社, 2008.

　　3 义华，徐梅珍，于学平，等. 质粒DNA碱裂解提取法的改进. 江西农业大学学报(自然科学版),2002,24(6):851～53.

　　4 姚伟,周会, 徐景升, 等. 质粒DNA小量提取法的改进.应用与环境生物学报,2005，11(6)：776～778

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