β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定

jz066520 · 发表于 2014-6-7 12:11:52

作者：邱文洪吴丽娜叶许楚娟易路阳郭凯文

【摘要】目的：构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体并鉴定。方法：通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆β半乳糖苷结合凝集素9基因，插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果：DNA测序和酶切鉴定证明β半乳糖苷结合凝集素9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论：成功构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体pGal9。

【关键词】 Gal9; 构建; 真核表达载体

半乳糖凝集素家族(galectin family)成员参与了许多生理和病理过程，包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等[1，2]。β半乳糖苷结合凝集素9(Gal9)是一种糖结合蛋白，属于半乳糖凝集素家族(galectin family)成员，组织分布广泛，在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等方面，发挥着重要作用[3]。目前对Gal9发挥作用的具体机制仍知之甚少，值得进一步深入探讨和研究，从而使Gal9作为疾病治疗的新的靶点成为可能。为此，本研究拟通过构建表达人Gal9蛋白的真核表达载体，为进一步研究Gal9的作用机制打下基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　T4连接酶、限制性内切酶(MBI)，Taq酶和RT试剂盒(Promega)，RNA提取试剂盒(Invitrogen)，质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒(Qiagen)，DNA marker(Tiangen)，Trizol、1640培养基，人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Galectin9引物(英骏生物技术有限公司)。

　　1.2 引物设计

　　参照GenBank上Gal9(NM009587.2)序列设计引物如下:上游引物

1 5'CCAAGCTTGGGTTAAGTCGTTCCCTCTACAA 3'，下游引物

2 5'CGGAATTCCGAGGACCCAGACTGCCCCAC 3'，下划线分别为HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,扩增Gal9的CDS序列,共1176 bp。

　　1.3 分离人外周血单个核细胞

　　静脉取血，加入肝素溶液(10～50u/m1血样本)抗凝，用pH7.2 Hanks液将抗凝血稀释1倍;吸取人淋巴细胞分离液置于刻度离心管中，加入稀释的全血; 2000 r/min离心20min;吸取所有单个核细胞，用Hanks液洗涤细胞3次。将单个核细胞离心收集备用。

　　1.4 单个核细胞总RNA的制备、RTPCR及克隆入载体pcDNA3.1(+)

　　将离心收集的单个核细胞1×105加入Trizol 1 mL，混匀，室温5 min;加0.2 mL氯仿，涡旋15 s， 4℃12 000g，离心10 min，吸取上清液至另一1.5 mL Eppendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，放置10 min，4℃12 000g，离心10 min，去上清液，加入1 mL预冷的浓度为750 mL/L乙醇，充分混匀振荡，4℃12 000g，离心10min，去上清液，充分干燥，用50μL含1 mL/L DEPC的ddH2O溶解沉淀，获得细胞总RNA。取5μL总RNA，按RTPCR试剂盒推荐方法以oligo(dT)为引物合成cDNA第一链。取2μl逆转录产物为模板,加入10 mM dNTP 1. 5 ml,10′PCR缓冲液5m,l 50mMMgSO41m,l两引物各10pmo,l补水至50m,l PCR反应条件为: 95℃预变性5 min，94℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，反应30个循环后，72℃延伸10 min。取PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析。按照Wizard PCR产物纯化试剂盒说明书纯化，回收PCR产物，经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，定向插入表达载体pcDNA3.1(+)的相应位点。该质粒命名为pGal9，经PCR、HindⅢ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定序列的正确性。

　　1.5 统计学方法

　　采用Prism4.0软件行单因素方差分析，以及组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Gal9的RTPCR扩增

　　从单个核细胞中提取细胞总RNA，以此为模板，应用前述引物进行RTPCR，将扩增产物于10 g/L琼脂糖电泳中，可见分布于Marker 1.0～1.5 kb的特异条带，与预计长度1176 bp相符(图1)。　2.2 真核质粒pGal9构建和鉴定

　　将RTPCR扩增产物，经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)。阳性克隆送英骏公司测序，同时进一步对阳性重组质粒进行PCR和双酶切鉴定。以阳性重组质粒为模板，用前述特异性引物进行PCR，可扩增出与预计长度1176 bp相符的目的片段，而空载体则为阴性结果(图2A)。阳性重组质粒经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后电泳，同样可见与预计长度相符的片段(图2B)。测序结果表明，PCR扩增获得并克隆的Gal9片段序列与GenBank中的序列完全一致(结果未附)。1 Marker;2 RTPCR product of Gal9 gene图1 RTPCR扩增Gal9基因CDS序列A PCR analysis：1 Marker;2 PCR product of pGal9;3 PCR product of pcDNA3.1(+);B Double restriction enzyme digestion analysis：1 Marker;2 pcDNA3.1(+)dynamitin digested with HindⅢ and EcoRⅠ;3 pGal9dynamitin digested with HindⅢ and EcoRⅠ。　　图2 真核表达质粒pGal9的PCR和双酶切鉴定

　　3 讨论

　　半乳糖凝集素家族(galectin family)是含有一个保守糖识别域的β半乳糖苷结合凝集素。半乳糖凝集素家族有15名成员，广泛参与许多生理和病理过程，包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等[1,2]。β半乳糖苷结合凝集素9(Gal9)是一种糖结合蛋白，属于alectin家族成员，组织分布广泛，具有多种生物学活性，参与细胞聚集和粘附、增殖、死亡和调节炎症及免疫反应等多种生理和病理过程[3]。为进一步研究Gal9的作用机制，我们通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Gal9基因，插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建了包含Gal9基因的真核表达载体pGal9。为鉴定真核表达载体pGal9，以阳性重组质粒为模板，用前述特异性引物进行PCR，证明获得的真核表达载体pGal9可扩增出与预计长度1176 bp相符的目的片段，而空载体则未见PCR扩增产物。获得的真核表达载体pGal9经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后电泳，同样可见与预计长度相符的片段。测序结果证明，PCR扩增获得并克隆的Gal9片段序列与GenBank中的序列完全一致。通过上述实验可以证明我们成功构建并获得了包含Gal9目的基因的真核表达载体pGal9。

　　在Gal9当初被发现时，引人注意的是ECA活性[4]，然而随着研究的不断深入，Gal9越来越多的生物学功能被人们所了解，这使得人们对Gal9乃至整个galectin家族的兴趣日益浓厚。研究发现，Gal9通过诱导Th1细胞凋亡，抑制Th17细胞的产生，增加调节性T细胞的生成，来改善小鼠自身免疫性疾病模型的严重性，如实验性脑脊髓炎(EAE)[5]和胶原性关节炎(CIA)[6]。相信今后的免疫学研究方向不仅关注于galectin家族的其他成员，还将对Gal9发挥作用的具体机制，尤其是对免疫系统的影响作进一步深入探讨，从而使Gal9作为免疫病理性疾病治疗的新的靶点成为可能。

　　综上所述，我们成功克隆了能够正确表达Gal9目的基因的真核表达载体pGal9，为进一步研究的Gal9功能提供方便，并为进一步探讨Gal9对免疫系统的影响奠定了基础。

【参考文献】
　1Elola MT, WolfensteinTodel C, Troncoso MF, Vasta GR, Rabinovich GA. Galectins: matricellular glycanbinding proteins linking cell adhesion, migration, and survival. Cell Mol Life Sci, 2007，64:1679～700.

　　2 Hasan SS, Ashraf GM, Banu N. Galectinspotential targets for cancer therapy. Cancer Lett, 2007，253:25～33.

　　3 Hirashima M, Kashio Y, Nishi N, et al. Galectin9 in physiological and pathological conditions. Glycoconj J, 2004，19: 593～600.

　　4 Mitsuomi Hirashima, Yumiko Kashio, Nozomu Nishi,et al. Galectin9 in physiological and pathological Conditions. Glycoconjugate, 2004，19: 593～600.

　　5 Anderson AC, Anderson DE, Bregoli L, et al. Promotion of tissue inflammation by the immune receptor Tim3 expressed on innate immune cells. Science, 2007， 318: 1141～1143.

　　6 Seki M, Oomizu S, Sakata KM, et al. Galectin9 suppresses the generation of Th17, promotes the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune arthritis. Clin Immunol, 2008，127(1): 78～88.

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