哈蟆油对D-半乳糖致衰老模型雌性大鼠的实验研究

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  作者：姚晖，姚锐， 原海晓， 王晓娟， 邓虹珠

【摘要】  　　目的观察哈蟆油(OR)对D-半乳糖所致雌性衰老模型大鼠血清和肝组织超氧化物歧化酶(SOD)及其分型铜锌-SOD（CuZn-SOD）、过氧化物酶(POD)、总抗氧化能力（T-AOC）等活性的影响。方法采用SPF级雌性SD大鼠40只，随机分为OR高、中、低剂量组和模型组，每组8只，D-半乳糖颈背部皮下注射6周。另设一组8只，同样部位每日注射生理盐水，作为正常对照组。第3周开始灌胃给药，模型对照组和正常对照组灌胃植物油。给药结束后收集标本，采用紫外分光光度法测定血清和肝组织总SOD，CuZn-SOD，POD，T-AOC的水平。结果模型组大鼠血清和肝组织总SOD、CuZn-SOD、POD和T-AOC活性明显降低，与其他各组比较有显著性差异（P＜0.01）。OR高剂量组比中、低剂量组能显著提高血清中上述指标数值（P＜0.05，P＜0.01）；OR中剂量比低剂量组能显著提高血清SOD，CuZn-SOD活性（P＜0.05）。OR高剂量组比低剂量组能显著提高肝组织中上述指标（P＜0.01）。结论OR明显提高老年雌性大鼠血清和肝组织SOD、CuZn-SOD，POD和T-AOC活性。OR能够增强衰老雌性大鼠抗氧化应激水平，从而改善其衰老程度。

【关键词】  哈蟆油； 抗衰老；超氧化物歧化酶；铜锌-SOD； 过氧化物酶； 总抗氧化能力

    哈蟆油(Oviductus Ranae,OR)为蛙科动物中国林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的输卵管，经采制干燥而得,味甘、咸、平，归肺、肾经，具补肾益精、养阴润肺的功效，是一种扶正固本的药物，为我国特产的动物中药材［1,2］。哈蟆油能够显著延长果蝇的平均寿命和最高寿命，并且对老年大鼠具有抗氧化作用［3,4］。已证实，哈蟆油能降低D-半乳糖雌性衰老模型小鼠卵巢子宫中MDA含量，提高其SOD活力，增强生殖器官抗氧化作用，从而改善其萎缩和衰老程度［5］。以哈蟆油为主药的中药复方益妇宁可以提高血清雌二醇，通过多环节调节生殖内分泌功能，治疗更年期综合征及有关诸证疗效确切［6,7］。

    本实验采用D-半乳糖所致雌性衰老大鼠作为实验对象，考察哈蟆油对氧化应激水平的影响，进一步探讨哈蟆油延缓雌性衰老的作用。

　　1  材料与仪器

　　1.1  动物SPF级健康SD雌性大鼠40只，体质量180～200 g，由南方医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：2006A044。饲养室温度：20～25℃，相对湿度：40％～70％。实验动物中心使用许可证号：SCXK(粤)2006-0015。置动物于室温18～22℃，相对湿度65％，光照周期12 h∶12 h条件下饲养。自由饮水、进食普通饲料。鼠笼垫板与饮水瓶定时换洗，保持清洁。

　　1.2  药材和试剂哈蟆油细粉(南方医科大学中医药学院制剂教研室提供，批号：071210，100目)；D-半乳糖（国药集团化学试剂有限公司，批号F20080429）；超氧化物歧化酶(SOD)及其分型CuZn-SOD、过氧化物酶(POD)，总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供(批号20090317)；食用植物油；冰醋酸为分析纯（广东光华化学厂有限公司，批号：20080512），其他试剂均为分析纯。

　　1.3  仪器岛津UV1700PharmaSpec（日本），FSH-2型可调高速匀浆器（江苏金坛市荣华仪器制造有限公司）；PL-303型电子天平（瑞典METTLER TOLEDO公司）；Sigma 3K30型低温高速离心机（Sigma公司）；L420台式低速自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；DK-8AD型电子恒温水浴箱（上海一恒科技有限公司）。

　　2  方法

　　2.1  动物模型及分组取SD雌性大鼠随机分成5组，每组8只，分别为正常对照组，模型组，哈蟆油高、中、低剂量组。除正常对照组外的32只大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖(350 mg／kg)，用生理盐水配制成14%溶液，用量按每次0.25 ml/100 g体质量计。正常对照组8只同样部位注射生理盐水，1次/d，连续6周。第3周开始，将32只模型大鼠随机分为4组，即OR高、中、低剂量组，模型组。按照“实验动物与人按体表面积等效量换算比率”可算出大鼠用药量：OR等效量为0.9 g／kg。OR高剂量为1.8 g/kg，中剂量组为0.9 g/kg，低剂量组为0.45 g／kg。OR以植物油配制。模型组和正常对照组灌胃植物油。

　　2.2  检测指标末次灌胃后腹主动脉采血，8 h内分离血清，-20℃保存。

　　2.2.1  肝上清液制备大鼠处死后，迅速剪开腹腔，剥离肝脏，称重后按1∶9(W∶V)加入一定体积的4℃预冷的生理盐水，用匀浆器在冰浴中匀浆，取10%的组织匀浆在低温离心机(4℃,2 000 r/min)离心15～20 min，取上清液待测。

　　2.2.2  指标测定SOD,CuZn-SOD活力，POD，T-AOC的活性按照试剂盒方法测定。

　　2.3  统计学处理实验数据用±s表示，采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），如有显著性差别，则组间两两显著性比较采用LSD法，显著性标准为0.05或0.01。　3  结果

　　3.1  雌性衰老大鼠血清SOD，CuZn-SOD，POD和T-AOC活性变化从表1中可以看出，模型组大鼠血清总SOD，CuZn-SOD，POD和T-AOC活性比正常对照组显著降低（P＜0.01），说明造模成功。与模型组比较，OR高、中、低剂量组均可显著提高衰老模型雌性大鼠血清SOD、CuZn-SOD、POD和T-AOC活性（P＜0.01），高剂量组比中、低剂量能显著提高血清中上述指标数值（P＜0.01，P＜0.05）；中剂量比低剂量组能显著提高血清SOD、CuZn-SOD活性（P＜0.01），中剂量组在其他指标上虽数值上高于低剂量组但无显著性差异（P＞0.05）。

　　3.2  雌性衰老大鼠肝组织SOD，CuZn-SOD，POD和T-AOC活性变化从表2可以看出，模型组大鼠肝组织总SOD，CuZn-SOD，POD和T-AOC活性比正常对照组显著降低（P＜0.01），OR高、中、低剂量组比模型组均可显著提高衰老模型雌性大鼠肝组织总SOD、CuZn-SOD、POD和T-AOC活性（P＜0.01），高剂量组比低剂量组能显著提高肝组织中上述指标（P＜0.01），高剂量比中剂量组，除T-AOC外（P＞0.05），其他指标均有显著性差异（P＜0.01）；中剂量与低剂量组比较，除T-AOC外，其他指标均有显著性差异（P＜0.05）。表1  雌性衰老大鼠血清SOD，CuZn-SOD，POD和T-AOC活性变化（略）表2  雌性衰老大鼠肝组织SOD,CuZn-SOD,POD和T-AOC活性变化（略）

　　4  讨论

    衰老是从生殖成熟后才开始或加速的,它是具有累积性、普遍性、渐进性、内生性的生命过程，是所有生物的共同特征［8］。D-半乳糖致亚急性衰老模型因其衰老变化明显，模型稳定，在抗衰老研究中被广泛应用［9］。Harman［10］于1955年最早提出了自由基与衰老有关。自由基(free radical)是指带有未配对电子的粒子，化学性质极为活泼，易对机体产生迅速而强烈的损伤。自由基的种类繁多，其中以O2-·和·OH等活性氧簇自由基 (Reactive oxygen species，ROS) 最为重要，主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢，它对生物体内大分子产生极大的危害作用。随着年龄的增长，机体内产生自由基以及防御自由基系统之间的平衡被打破，自由基的累积增多，清除率下降，同时伴随衰老的发生。

    为保护机体免受过氧化损伤，细胞形成了一套复杂的抗氧化酶防御系统。机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。因此测定血浆、血清、尿液、唾液等各种体液及细胞或组织等裂解液中的总抗氧化能力具有非常重要的生物学意义。SOD、POD是细胞内清除活性氧系统中的重要酶，能有效地阻止氧离子(O-2)和双氧水(H2O2)在生物体内积累。它们和其他一些生物活性物质组成了生物体内清除活性氧自由基的多酶复合体，具有抗自由基的联合、协同作用［11］，防止细胞受自由基的毒害，较高的保护酶活性的存在，能够抑制膜脂过氧化，延缓细胞衰老。

    本课题前期发现哈蟆油可提高去势大鼠血清性激素水平，增强脾脏雌激素受体（ER）表达，明显提高D-半乳糖所致雌性衰老模型小鼠体内雌激素水平，延长小鼠动情期：增加其卵巢和子宫指数，改善卵巢和子宫的病理改变，降低卵巢子宫中MDA含量，提高其SOD活力。能够延缓雌性小鼠生殖衰老，增强生殖器官抗氧化作用，从而改善其萎缩和衰老程度。发现能促进小鼠的免疫调节功能,提高小鼠的应激能力、耐疲劳能力及小鼠清除自由基和抗氧化的能力,具有延缓机体衰老的作用［5，12］。本实验结果表明，D-半乳糖所致衰老模型组雌性大鼠血清和组织中SOD，CuZn-SOD，POD和T-AOC活性较正常对照组明显降低，OR高、中、低剂量组比模型组均可显著提高上述指标，提高程度与剂量呈一定的正比关系，OR高剂量作用更明显，说明哈蟆油能提高雌性衰老大鼠血清和组织中SOD，CuZn-SOD，POD值和明显提高总抗氧化能力，显示了体内抗氧化酶防御系统能力的恢复和增强。

    本研究表明，在动物实验上显示哈蟆油通过对氧化应激水平的影响，显示具有明显的抗衰老的作用。随着分子生物学技术的日趋成熟， 衰老机制的研究已经进入基因水平。细胞衰老作为衰老的基本过程，已经发现一些基因及转录因子（反式作用因子）与细胞衰老密切相关。因此，应用分子生物学技术，配合中药药代动力学研究，从细胞及分子水平上阐明该药抗衰老的作用机制是对其药理作用的全面研究进行的有益探索。

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　　［3］于玲媛,梅松柳,吴英俊.牡丹江产哈士蟆油对果蝇抗衰老的实验研究［J］.中国林副特产,2004,1:30.

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　　［6］刘晓伟,邓虹珠.益妇宁治疗更年期综合征65例临床观察［J］.中国中医药科技,2002,9(6):353.

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　　［9］朱亚珍,朱虹光.D-半乳糖致衰老动物模型的建立及其检测方法［J］.复旦大学学报(医学版), 2007,34(4):617.

　　［10］Harman D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry［J］.Gerontol,1956, 11(3): 298.

　　［11］潘安中,谢树莲,秦雪梅.不同年份柴胡种子SOD、POD活性与发芽率的测定［J］.天津中医药,2008,25(3):243.

　　［12］吴朝霞,王晓华,刘 桦,等.莪术、哈蟆油对去势后大鼠雌激素水平及受体表达的影响［J］.南方医科大学学报, 2008,28(5):746.