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【摘要】 目的研究黄芪多糖（APS）对糖尿病大鼠肾组织胰岛素受体（IR）及胰岛素受体底物1（IRS1）表达的影响及其治疗糖尿病的作用机制。方法用APS治疗高脂饮食喂养加小剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射诱导糖尿病（DM）大鼠，检测血糖，IR及IRS1的变化，观察APS对糖尿病大鼠的作用。结果DM大鼠血糖含量明显升高（P<0.01），IR及IRS-1表达明显降低（P<0.01）；APS能明显增加DM大鼠IR及IRS-1的表达（P<0.01），降低血糖水平（P<0.01）。结论 APS可降低糖尿病大鼠血糖水平，其机制可能与提高糖尿病大鼠肾组织中IR，IRS1的表达，增加组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素信号传导有关。
【关键词】 黄芪多糖 糖尿病肾病 胰岛素受体 胰岛素受体底物1
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发病机制尚未完全阐明，已有研究证实直接或间接与高血糖有关，糖尿病状态下机体糖代谢严重障碍。胰岛素（insulin，Ins）是调节糖代谢最主要的激素，其生物效应由其靶细胞膜上胰岛素受体(insulin receptor, IR）介导，胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1,IRS1）是IR下游第一个底物分子，在其信号传导途径中起着极其重要的作用，已有的研究表明糖尿病状况下肾脏组织细胞膜胰岛素受体的数目和亲和力均存在异常［1，2］。本研究运用黄芪多糖（APS）治疗高脂饮食喂养加小剂量链脲佐菌素（STZ）注射诱导糖尿病（Diabetes Mellitus，DM），拟进一步观察APS对糖尿病状态下肾脏组织IR与IRS1蛋白表达的影响，探讨其影响机制。
1 材料与方法
1.1 材料健康清洁级雄性SD大鼠40只，体重180～200 g，由武汉大学实验动物中心提供。STZ，美国Sigma公司。APS溶液：APS从山西产黄芪根中提取制成粉剂，临用前用生理盐水新鲜配制成20 g/L的溶液。鼠IRS－1单克隆抗体，美国Neomarkers公司。兔InsR多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司。SP试剂盒，北京中山生物技术公司。One touchⅡ血糖测定仪及试纸，美国Janson and Janson公司。切片机，国产LKB11800。显微镜，日本OlympasCH30。HPIAS1000型全自动图像分析系统。
1.2 方法
1.2.1 糖尿病模型的建立与分组
实验动物分为4组。正常对照组：给予普通饲料（60%碳水化合物，22%蛋白质，10%豆油脂肪，包括纤维素在内的其他成分8%）喂养，用等体积生理盐水灌胃处理5周。APS对照组：普通饲料，APS溶液［400 mg/（kg·d）］灌胃处理5周。DM组：给予高脂饲料（41%脂肪，41%碳水化合物和18%蛋白质），尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）（30 mg/kgSTZ，溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲盐溶液，pH 4.5），注射后动物自由进食，进水并维持高脂饮食，STZ注射72 h后，测动物空腹血糖，大于6.7 mmol/L者可诊断为糖尿病［3］。DM+APS组：空腹血糖大于6.7 mmol/L的动物继续喂以高脂饲料，同时APS溶液［400 mg/（kg·d）］灌胃处理5周。
1.2.2 各项指标检测
所有大鼠观察毛发、活动等情况，并取尾静脉血测空腹血糖。
1.2.3 IR与IRS-1蛋白的检测
处死动物后，取肾组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片（4 μm）；3%H2O2室温孵育10 min；5%～10%正常山羊血清封闭10 min；加入一抗，37℃孵育1～2 h；滴加生物素标记的二抗，37℃10 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链卵白素，37℃10 min；DAB显色，室温3 min；苏木素复染1 min；酒精脱水；中性树胶封片。免疫组化图像分析应用高清晰彩色病理图像免疫组化测量系统（HPIAS1000），经标准灰度校正后，随机取5个视野，分别测定IR，IRS-1的平均光密度值（IDP）。
1.2.4 统计学处理
采用SPSS11.5统计软件进行，实验数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较用t检验。P<0.01有显著性差异。
2 结 果
2.1 实验动物一般情况
DM大鼠毛发干枯、杂乱、脱落、蜷卧、活动减少。给APS治疗后，大鼠精神好转、毛发光整、有色泽、活动增多。
2.2 血糖 如表所示，DM组和DM+APS组血糖水平均高于对照组，差别有显著性（P<0.01），DM+APS组血糖水平低于DM组，差别有显著性（P<0.01）。【摘要】 目的研究黄芪多糖（APS）对糖尿病大鼠肾组织胰岛素受体（IR）及胰岛素受体底物1（IRS1）表达的影响及其治疗糖尿病的作用机制。方法用APS治疗高脂饮食喂养加小剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射诱导糖尿病（DM）大鼠，检测血糖，IR及IRS1的变化，观察APS对糖尿病大鼠的作用。结果DM大鼠血糖含量明显升高（P<0.01），IR及IRS-1表达明显降低（P<0.01）；APS能明显增加DM大鼠IR及IRS-1的表达（P<0.01），降低血糖水平（P<0.01）。结论 APS可降低糖尿病大鼠血糖水平，其机制可能与提高糖尿病大鼠肾组织中IR，IRS1的表达，增加组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素信号传导有关。
【关键词】 黄芪多糖 糖尿病肾病 胰岛素受体 胰岛素受体底物1
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发病机制尚未完全阐明，已有研究证实直接或间接与高血糖有关，糖尿病状态下机体糖代谢严重障碍。胰岛素（insulin，Ins）是调节糖代谢最主要的激素，其生物效应由其靶细胞膜上胰岛素受体(insulin receptor, IR）介导，胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1,IRS1）是IR下游第一个底物分子，在其信号传导途径中起着极其重要的作用，已有的研究表明糖尿病状况下肾脏组织细胞膜胰岛素受体的数目和亲和力均存在异常［1，2］。本研究运用黄芪多糖（APS）治疗高脂饮食喂养加小剂量链脲佐菌素（STZ）注射诱导糖尿病（Diabetes Mellitus，DM），拟进一步观察APS对糖尿病状态下肾脏组织IR与IRS1蛋白表达的影响，探讨其影响机制。
1 材料与方法
1.1 材料健康清洁级雄性SD大鼠40只，体重180～200 g，由武汉大学实验动物中心提供。STZ，美国Sigma公司。APS溶液：APS从山西产黄芪根中提取制成粉剂，临用前用生理盐水新鲜配制成20 g/L的溶液。鼠IRS－1单克隆抗体，美国Neomarkers公司。兔InsR多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司。SP试剂盒，北京中山生物技术公司。One touchⅡ血糖测定仪及试纸，美国Janson and Janson公司。切片机，国产LKB11800。显微镜，日本OlympasCH30。HPIAS1000型全自动图像分析系统。
1.2 方法
1.2.1 糖尿病模型的建立与分组
实验动物分为4组。正常对照组：给予普通饲料（60%碳水化合物，22%蛋白质，10%豆油脂肪，包括纤维素在内的其他成分8%）喂养，用等体积生理盐水灌胃处理5周。APS对照组：普通饲料，APS溶液［400 mg/（kg·d）］灌胃处理5周。DM组：给予高脂饲料（41%脂肪，41%碳水化合物和18%蛋白质），尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）（30 mg/kgSTZ，溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲盐溶液，pH 4.5），注射后动物自由进食，进水并维持高脂饮食，STZ注射72 h后，测动物空腹血糖，大于6.7 mmol/L者可诊断为糖尿病［3］。DM+APS组：空腹血糖大于6.7 mmol/L的动物继续喂以高脂饲料，同时APS溶液［400 mg/（kg·d）］灌胃处理5周。
1.2.2 各项指标检测
所有大鼠观察毛发、活动等情况，并取尾静脉血测空腹血糖。
1.2.3 IR与IRS-1蛋白的检测
处死动物后，取肾组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片（4 μm）；3%H2O2室温孵育10 min；5%～10%正常山羊血清封闭10 min；加入一抗，37℃孵育1～2 h；滴加生物素标记的二抗，37℃10 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链卵白素，37℃10 min；DAB显色，室温3 min；苏木素复染1 min；酒精脱水；中性树胶封片。免疫组化图像分析应用高清晰彩色病理图像免疫组化测量系统（HPIAS1000），经标准灰度校正后，随机取5个视野，分别测定IR，IRS-1的平均光密度值（IDP）。
1.2.4 统计学处理
采用SPSS11.5统计软件进行，实验数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较用t检验。P<0.01有显著性差异。
2 结 果
2.1 实验动物一般情况
DM大鼠毛发干枯、杂乱、脱落、蜷卧、活动减少。给APS治疗后，大鼠精神好转、毛发光整、有色泽、活动增多。
2.2 血糖 如表所示，DM组和DM+APS组血糖水平均高于对照组，差别有显著性（P<0.01），DM+APS组血糖水平低于DM组，差别有显著性（P<0.01）。 2.3 IR和IRS-1的表达
免疫组化图像分析IR和IRS-1的平均光密度值（IDP）见表，DM组肾组织IR，IRS-1表达水平均低于对照组，差别有显著性（P<0.01）；DM+APS组IR、IRS-1表达水平均高于DM组，差别有显著性（P<0.01）；APS不影响正常对照大鼠肾的IR和IRS-1的表达。
3 讨论
胰岛素经血液循环到达相应靶组织后，与其上的胰岛素受体α亚单位相结合，激活其β亚单位的内在激酶活性，导致IR自磷酸化。磷酸化的IR一方面为其它信号分子提供结合位点，另一方面其磷酸激酶可致IRS－1磷酸化。IRS－1被磷酸化后即暴露出特异性结合位点，能募集并激活含有SH2区域的蛋白质激酶磷脂酰肌醇3激酶（PI3K），使信号以激酶链式反应下传。IRS－1通过激活PI3K激酶导致磷酸肌醇依赖的蛋白激酶（PDK1）的激活，后者可使蛋白激酶B（PKB）磷酸化，活化的PDK1或磷酸化的PKB可导致葡萄糖转移因子4（GLUT4）的合成、分泌、移位等变化［4，5］。GLUT4是直接影响葡萄糖入胞的细胞因子，对血糖的调节极其重要。现有资料表明，血糖的调节主要受IR/IRS－1/PI3K/PDK1/PKB/GLUT4信号途径的影响，所以当其信号径路中IR和IRS发生障碍或异常时可导致糖尿病［4，5］。
本实验结果表明：DM组血糖水平明显高于对照组，提示本实验所用动物模型符合糖尿病的特征。DM+APS组血糖水平明显低于DM组，且明显高于对照组，提示APS能明显降低糖尿病大鼠血糖水平，改善糖尿病糖代谢紊乱，但不能使血糖水平恢复正常。DM组肾组织IR，IRS1的表达水平均明显低于对照组，这说明糖尿病IR，IRS1表达水平降低，胰岛素信号传导在受体和受体后环节障碍，即Ins与IR的结合能力及受体后效应均减弱。胰岛素介导的肌肉和脂肪组织摄取葡萄糖能力降低，肝脏葡萄糖生成增加，最终导致高血糖产生。持续高血糖刺激使IR数目下降，水平降低，加重糖尿病。IR表达水平降低，胰岛素信号向下传递减弱，导致IR刺激的IRS1酪氨酸磷酸化障碍，受体后效应减弱。实验结果还显示：DM+APS组IR，IRS1表达水平均明显高于DM组，这说明APS能有效增加IR，RS1的水平。APS通过增加肾组织IR表达，改善其对胰岛素的敏感性，使受体环节的胰岛素信号传导障碍减轻，这是其治疗糖尿病肾病的作用机制之一。同时它通过增加IRS1表达，改善受体后信号传导障碍，治疗糖尿病肾病。
APS是从豆科植物黄芪中提取出来的有较强生物活性的大分子复合物，研究表明，APS具有良好的降糖效果［6］，其作用机制可能是通过有效增加IR，IRS1的表达水平，增强组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素受体和受体后环节信号传导有关，该研究为临床用APS治疗糖尿病提供了理论依据。
【参考文献】
［1］Shao J,Yamashita H,Qiao L,et al. Phosphatidylinositol 3-kinase redistribution is associated with skeletal muscle insulin resistance in gestational diabetes mellitus［J］.Diabetes,2002,51：19.
［2］Kido Y,Burks D J,Withers D,et al. issue-specific insulin resistance in mice with mutations in the insulin receptor,IRS-1,and IRS-2［J］.J Clin Invest,2000,105：199.
［3］Wu Y, Ou-Yang JP, Wu Ke, et al.Hypoglycemic effect of Astragalus polysaccharide and its effect on PTP1B［J］.Acta Pharm.Sin, 2005, 26(3)：345.
［4］Pagliassotti MJ,Kang J,Thresher JS,et al. Elevated basal PI 3-kinase activity and reduced insulin signaling in sucrose-induced hepatic insulin resistance［J］. Am J Physiol(Endocrinol Metab),2002,282：E170.
［5］Karlsson M,Thorn H,Parpal S,et al. Insulin induces translocation of glucose transporter GLUT4 to plasma membrane caveolae in adipocytes［J］. FASEB J, 2002,16:249.
［6］黄 桢. 黄芪多糖的药理研究进展［J］.中国临床药学杂志,2002,11(5)：315. |
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发表于 2014-8-19 22:03:25
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