麻竹叶黄酮的毒理学实验

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【摘要】  目的利用麻竹叶黄酮进行了小鼠急性毒性实验和致突变实验。方法采用急性毒性实验、小鼠精子畸形实验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验和鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体实验。结果小鼠经口LD50>25 g·（kg·bw）-1，腹腔注射LD50>10 g·（kg·bw）-1；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变；没有对小鼠骨髓细胞染色体的断裂效应及纺锤体毒效应；也对小鼠精子的畸形无影响。结论竹叶黄酮是一种安全的保健食品功能因子。但对人体有无毒副作用还需作临床实验。

【关键词】  竹叶黄酮 半数致死量 Amees实验 微核 致突变作用 毒理学

　　Toxicological Test on Flavonoids from Leaves of Dendrocalamus Latiflorus

　　Abstract:ObjectiveAcute toxicity experiments and mutation experiments were conducted on mice with the flavonoids from the leaves of Dendrocalamus latiflorus.MethodsBy means of acute toxicity test, malformation test of mice sperm, micronucleus test of  bone marrow cell and Ames test .ResultsLD50（ig） for mice was more than 25 g·（kg·bw）-1 and in LD50（ip） for mice was more than 10 g·（kg·bw）-1. Mutagenic action of flavonoid from bamboo leaves on TA97，TA98，TA100 and TA102，and toxic effect on mice marrow micronucleus as well as effect on malformation of mice sperm were all negative.ConclusionThe flavonoids from leaves of Dendrocalamus latiflorus was a type of secure function factor of healthy food，but whether it has toxic or negative effect on human or not it need further observation in clinical application.

　　Key words:Flavonoids from bamboo leaves（FBL）；  LD50；Ames experiment；Micronucleus；Mutation experiments；  Toxicology

    麻竹Dendrocalamus latiflorus又名甜竹、八月麻（福建），属禾本科牡竹属，是广泛分布于我国福建、台湾、广东、广西、云南、贵州和四川等南亚热带和热带地区的大型丛生竹种［1］。麻竹叶大，宽4～7 cm以上，内含有丰富的营养物质，很值得开发利用。竹叶在我国具有悠久的食用和药用历史［2～4］。竹叶提取物具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、调节血脂、阻断亚硝化反应、增强免疫和抗菌抑菌的作用［2～4］。竹叶中所含的功能因子主要是黄酮糖苷和香豆素类内酯等［3,4］。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验用竹叶黄酮系麻竹叶黄酮，本实验室自备［2］，总黄酮>80%。

　　1.1.2  实验动物昆明种小鼠：为BALB/C纯系小鼠（医动字2004第002号），♂，♀各半，8～10周龄，体重18～20 g，由重庆市中药研究院实验动物中心提供。

　　1.1.3  菌株鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株TA97，TA98（移码型突变株）和TA100，TA102（碱基置换型突变株）：均由重庆市疾控中心提供。

　　1.2  方法

　　1.2.1  竹叶黄酮的经口（ig）、腹腔注射（ip）急性毒性（LD50）实验［5～7］采用霍恩法。实验剂量以最大注射量或经口灌胃不超过1 ml/只小鼠为限。竹叶黄酮经口的剂量组设4个组为2.15，4.64，10.0，21.5 g·（kg·bw）-1；竹叶黄酮经腹腔注射剂量组设4个组为1.00，2.15，4.64，10.00 g·（kg·bw）-1。取健康小鼠，禁食16 h后，给预受试物后观察7 d，记录小鼠的活动和死亡情况。

　　1.2.2  竹叶黄酮的鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体实验（Ames实验）［6,8～10］采用平板渗入法。实验菌株采用TA97，TA98（移码型突变株）和TA100，TA102（碱基置换型突变株），实验前菌种的5个遗传特征要作鉴定，达到规定的标准才能使用，并且在实验前均要在营养肉汤培养基中，于37℃水浴振荡培养14 h增菌，得到大约2×108的菌株悬浮液。按急性毒性实验所用腹腔注射最高剂量（10.00 g/kg）的1/10，1/20，1/40，1/80，1/160，1/320设6个剂量组，另设阴性对照组（竹叶黄酮为0 mg/平皿）和阳性对照组（2-AF、敌克松、叠氮钠），共10个实验组，并各实验组分别进行加S9（20 μl/平皿）活化和不加S9活化的实验，每次实验做3个平行样品，取两次实验的平均数，以超过自然回变数（阴性对照组）的2倍作为阳性判断标准。

　　1.2.3  竹叶黄酮的骨髓微核实验［9］取健康小鼠，随机分成5组，每组动物10只，按急性实验所用腹腔注射最高剂量〔10.00 g·（kg·bw）-1〕的1/2，1/4和1/8设3个剂量组，另设阳性对照组〔环磷酰胺40 mg·（kg·bw）-1〕和阴性对照组共5组，连续腹腔注射给药2d，1次/d。第2次给予受试物后6h，颈椎脱臼处死小鼠，取胸骨，用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片。涂片自然干燥后放入甲醇中固定5～10 min，再放入Giemsa应用液中，染色10～15 min，立即用pH 6.8的磷酸盐缓冲液冲洗晾干，写好标签，置干燥器中保存。选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域，在油镜下观察，以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准，观察嗜多染红细胞的微核（呈灰蓝色），而成熟红细胞呈粉红色。每只动物计数1 000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，计算微核率：

　　微核率（‰）= 含微核细胞数观察细胞数×1 000

　　1.2.4  竹叶黄酮的小鼠精子畸形实验［6,7,9］取健康小鼠，随机分成5组，每组动物10只，按急性实验所用腹腔注射最高剂量〔10.00 g·（kg·bw）-1〕的1/2，1/4和1/8设3个剂量组，另设阳性对照组〔环磷酰胺40 mg·（kg·bw）-1〕和阴性对照组共5组，连续腹腔注射给药5 d，于第1次腹腔注射给药后的第35天用颈椎脱臼处死小鼠，取出两侧副睾，放入盛有适量生理盐水（1   ml）的小烧杯中。用眼科剪将副睾纵向剪1～2刀，静置3～5 min，轻轻摇动，用4层擦镜纸过滤，吸滤液涂片。于空气中干燥后，用甲醇固定8 min，干燥后用1%～2%伊红染色1 h，用水轻冲，干燥。在低倍镜下（用绿色滤光片）找到清晰、精子重叠少的部位，用高倍镜顺序检查精子形态，计数结构完整的精子，每只动物至少检查1 000个精子，观察畸形精子数，计算精子畸形率：

　　精子畸形率（%）= 畸形精子数观察的精子数×100

　　1.2.5  数据处理采用SPSS统计软件进行t检验和方差分析，并以LDS法进行组间的两两比较，检验的显著性水平设定为P<0.05(显著水平)和P<0.01(极显著水平)。

　　2  结果与分析

　　2.1  竹叶黄酮的经口、腹腔注射急性毒性（LD50）实验结果见表1～2。表1  经口給药后小鼠毒性反应情况（略）表2  竹叶黄酮的经口急性毒性（略）

    从表1～2的实验数据可以看出：竹叶总黄酮经口LD50实验，小鼠的饮食、行动、皮毛、大便等均正常，未发现异常现象，无小鼠死亡，测不出其LD50。推测其LD50>21.50 g/kg·bw，属实际无毒。  从表3和表4可以看出：竹叶总黄酮经腹腔注射LD50实验，小鼠的饮食、行动、皮毛、大便等均正常，未发现异常现象，无小鼠死亡，测不出其LD50。推测其LD50>10.00 g·（kg·bw）-1，属实际无毒。表3  腹腔注射給药后小鼠毒性反应情况（略）表4  竹叶黄酮的经腹腔注射急性毒性（略）

　　2.2  竹叶黄酮的鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体实验（Ames实验）结果见表5～6。表5  竹叶黄酮对TA98和TA100 的致突变作用（略）表6  竹叶黄酮对TA97和TA102 的致突变作用（略）

　　由表5～6可知，麻竹叶黄酮的6个测试浓度在加S9 或不加S9活化的情况下，4个菌株TA97，TA98，TA100和TA102的回变菌落数均与阴性对照组很接近，没有显著性差异（P>0.05）且没有超过阴性对照组的2倍,而与阳性对照组比较要低得多,有极显著性差异(P>0.01)，因此竹叶黄酮不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变的现象。

　　2.3  竹叶黄酮的骨髓微核实验竹叶黄酮的骨髓微核实验结果见表7。表7  竹叶黄酮的骨髓微核实验结果（略）

    由表7可知,阳性对照组(环磷酰胺)具有微核嗜多染色红细胞数与阴性对照组(竹叶黄酮 0.00 g/kg)相比,差异极显著(P<0.01)。竹叶黄酮的各剂量组小鼠具有微核嗜多染红细胞率与阴性对照组相比，微核率值非常接近，无明显差异（P>0.05），且无剂量-效量关系，因此竹叶黄酮没有对小鼠骨髓细胞染色体的断裂效应及纺锤体毒效应。

　　2.4  竹叶黄酮的小鼠精子畸形实验结果见表8。表8  竹叶黄酮的小鼠精子畸形实验结果（略）

    由表8可知, 阳性对照组(环磷酰胺)具有小鼠精子畸形率与阴性对照组(竹叶黄酮 0.00 g/kg)相比,差异极显著(P<0.01)。竹叶黄酮的各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组相比，小鼠精子畸形率非常接近，均无显著差异（P>0.05），且无剂量-效量关系，揭示竹叶黄酮对小鼠精子的畸形无影响。

　　3  结论

    通过实验结果可得出如下结论：小鼠经口LD50>25 g·（kg·bw）-1，腹腔注射LD50>10 g·（kg·bw）-1，属实际无毒；竹叶黄酮各剂量组不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变；没有对小鼠骨髓细胞染色体的断裂效应及纺锤体毒效应；也对小鼠精子的畸形无影响。

    以上结果显示竹叶黄酮是一种安全的保健食品。但对人体长期毒副作用研究还需临床试验。

【参考文献】
  　　［1］《中国森林》编辑委员会.中国森林［M］.北京:中国林业出版社,2000，4:1961.

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　　［10］Wang XH., Andrae L., Engeseth NJ. Antimutagenic effect of various honeys and sugars against Trp-p-1［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry.2002, 50(23):6923.