痛必定注射液对慢性结扎损伤模型大鼠脊髓背角c-fos和P物质的影响

amy54321

【摘要】  目的痛必定注射液是具有良好镇痛效果的中成药，拟通过本实验研究了其镇痛机理。方法采用免疫组化的方法，研究痛必定注射液对CCI（慢性结扎损伤）模型大鼠脊髓背角c-fos基因表达和P物质含量的影响。结果痛必定注射液能明显降低CCI大鼠脊髓背角c-fos基因和P物质含量。结论该实验证实了痛必定注射液对CCI大鼠具有很好的镇痛作用，减少脊髓背角神经元对传入的伤害性刺激的反应,可能是其发挥镇痛作用的途径之一。

【关键词】  痛必定注射液 c-fos P物质 免疫组化

    痛必定注射液是由4种中药（有效成分或部位）组成的具有良好镇痛作用的中成药。其动物实验和临床应用均显示和度冷丁［1，2］有相似的镇痛效果，但无明显成瘾性。其镇痛作用产生的机理尚未完全清楚，且近年来研究表明，外周伤害性刺激等因素可激活脊髓内即刻早期基因c-fos并表达fos蛋白［3～6］；P物质(substance P ,SP)被认为是脊髓伤害性信息传递物质［7］,在脊髓痛觉信息传递过程中发挥着重要的作用［8］，二者是疼痛在分子水平的标志。本实验运用免疫组化方法研究了痛必定注射液对CCI（chronic constriction injur，慢性结扎损伤）模型大鼠脊髓背角浅层c-fos基因表达和SP含量的影响，初步探讨痛必定注射液的镇痛机理。

　　1  材料

　　1.1  动物成年Wistar大鼠，雌雄各半，体重（200±20） g，由吉林大学实验动物中心提供。

　　1.2  主要试剂痛必定注射液40 mg/支，加入生理盐水2 ml，即成为浓度20 mg/ml溶液。按20 mg/kg体重剂量腹腔注射。兔抗大鼠c-fos多克隆抗体(Santa CruzBiotechnology Inc. USA ,北京中山技术有限公司分装)，SP免疫组化染色试剂盒为武汉博士德生物技术有限公司产品，DAB染色试剂盒为北京中山技术有限公司产品，曲拉通X-100(Triton-100)为北京中山生物技术有限公司产品。

　　2  方法

　　2.1  分组、用药、造模Wistar大鼠30只，随机分成A（正常组）、B（CCI造模组）、C（CCI+痛必定）3组。将B组和C组大鼠在无菌条件下1%异戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，暴露左侧的坐骨神经干，在中部4～5 mm范围内，用4-0号铬制羊肠线打3～4个结，以引起小腿微微抽动为宜，然后逐层缝合。另一侧行假手术。14 d后用特制大鼠固定笼固定大鼠，SH—XYT型小型动物压痛仪（深圳凯强利股份有限公司），分别测量双侧后肢的痛阈值，左侧痛阈显著降低，并结合行为学改变，认为造模成功。C组按20 mg/kg体重剂量连续5 d腹腔注射痛必定注射液，B组同时给予同剂量生理盐水。

　　2.2  取材、切片1%异戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，快速开胸，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，进行心脏灌注。先以无菌生理盐水100 ml快速冲去血液，至流出的液体变清亮，随后用4℃含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)先快后慢灌流固定约30 min。打开脊柱，取脊髓L3～L5节段置于4℃含40 g/L多聚甲醛PBS中后固定4 h , 再移入4℃含300 g/L蔗糖的0.1 mol/L PBS(pH7.4)中直至组织沉底。冰冻切片机-20℃冠状连续切片，片厚5 μm。选取结构完整者贴于APES处理过的玻片上。

　　2.3  免疫组织化学反应

　　2.3.1  c-fos免疫组化反应采用SP法。切片入0.01 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗3 次，5 min/次；3%过氧化氢室温孵育30 min，以消除内源性过氧化物酶的影响，PBS漂洗3次，5 min/次；0.3% Triton-100室温孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min/次；正常羊血清封闭，室温孵育60 min，吸去封闭剂，不洗；1∶80 c-fos一抗(0.01 mol/ L PBS稀释)中4℃孵育过夜，室温复温30 min后，PBS漂洗3次，每次5 min；生物素标记二抗(羊抗兔血清)室温孵育60 min，PBS漂洗3次，5 min/次；辣根酶标记链酶卵白素，室温孵育40min，PBS漂洗3次，5 min/次；DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水充分冲洗，室温下避光干燥，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明,中性树胶封片。

　　2.3.2  SP免疫组化反应采用SABC法。切片入0.01 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗3 次，5 min/次；30%H2O2 1份加纯甲醇50份混合，室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水漂洗3次，5 min/次；滴加5 %BSA封闭液，室温30 min。吸去多余液体，不洗；滴加1∶200稀释的一抗，4℃过夜。室温复温30 min后，PBS漂洗3次，5 min/次；滴加生物素化二抗(羊抗兔血清)，室温孵育40min，PBS漂洗3 次，5 min/次；滴加试剂过氧化物酶(SABC)，室温40min ,PBS 漂洗4次，5 min/次； DAB显色，显微镜下控制显色时间，苏木素轻度复染，自来水充分冲洗，室温下避光干燥，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　2.4  免疫组化对照实验非特异性对照用正常羊血清代替c-fos或SP抗体，阴性对照用PBS代替c-fos或SP抗体,其它步骤同上。

　　2.5  图像观察、分析用Olympus显微镜观察每一张切片，Fos蛋白的测定方法采用免疫阳性（F-LI）神经元计数法，用低倍镜下每张切片脊髓背角所有F-LI数目表示数量（五张切片，取均值；单位：个）。SP的结果采用北京航空航天大学图像中心研制的CMIAS-多功能真彩色病理图像分析系统（版本4.0）进行分析，每张切片中SP免疫活性物质（SP-LI）阳性面积值（五张切片，取均值；单位：阳性单位）。

　　2.6  统计学方法

　　采用SPSS 9.0软件，数据用均数±标准差(±s)表示，组内比较用t检验；组间比较用单因素方差分析，并以q检验比较两两差异，P＜0.05认为差异显著。

　　3  结果

　　3.1  fos蛋白表达情况F-LI阳性神经元呈棕黄色，定位于细胞核，呈圆形或卵圆形，胞浆和核仁均不染色或染色较浅，易与周围背景区别开来。光镜下见脊髓背角浅层内有大量的fos免疫反应。结果显示：B组脊髓背角F-LI神经元数目明显高于正常组(P<0.01，t=16.381)；与B组比较，C组左侧脊髓背角的F-LI神经元数目明显降低(P<0.01，t=7.564)。免疫组化染色所显示的对照实验均呈阴性反应(见表1)。

　　3.2  P物质含量情况光镜下可见SP免疫阳性反应物主要分布于脊髓背角浅层,以外侧带最为浓密。脊髓的其他部位不着色或呈淡黄色。计算机图像分析检测结果显示:B组脊髓背角SP-LI的含量明显高于右侧和正常组(P<0.01，t=8.576)；与B组比较，C组大鼠脊髓背角的SP-LI含量明显降低(P<0.01，t=9.258，见表1)。表1  各组大鼠脊髓背角浅层F-LI和SP-LI含量比较（略）

　　4  讨论

    原癌基因c-fos是一种存在于正常神经元细胞核内的即刻早期基因，fos是其蛋白表达产物。正常情况下，细胞内c-fos很少表达，外周伤害性刺激等因素可激活脊髓内c-fos基因并表达fos蛋白。据报道大鼠CCI后脊髓背角Fos样或Jun样免疫反应阳性细胞数量显著升高［9］。Fos蛋白数量和分布还可以反映伤害性刺激强度和伤害性刺激作用的时间，是评价药物镇痛效能的有效方法［3～6］。    SP被认为是脊髓伤害性信息传递物质［7］，在脊髓痛觉信息传递过程中发挥着重要的作用［8］。其主要由背根神经节中的神经元合成，可通过快速轴浆运输系统同时向初级传入神经元的中枢突和外周端传递。它存在于脊髓Rexed I层和II层的Aδ和C 纤维上［10］，持续电、热、化学等多种外周伤害性刺激这些传入纤维可引起脊髓背角SP的释放，脊髓背角的SP明显增多［11，12］。

    本实验结果表明痛必定注射液能够明显降低CCI大鼠脊髓背角浅层中F-LI和SP-LI的含量，提示该药可减少脊髓背角神经元对传入的伤害性刺激的反应。这种反应既可以是传入的伤害性神经冲动降低的结果，也有可能是由于加强了大脑、脑干的下行抑制系统而使脊髓背角对传入冲动的反应性降低所致，具体机理有待于进一步探讨。



【参考文献】
  　　［1］王冰梅，侯 宜，许 侃.痛必定注射液镇痛作用机理的初步研究［J］.吉林中医药，2002，22（4）：51.

　　［2］曹 军.痛必定粉针对大鼠脊髓背角广动力范围神经元电活动的影响［J］.吉林中医药，2004，24（6）：54.

　　［3］Bullitt E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat［J］. ComNeurol， 1990，294∶517.

　　［4］Hunt SP , Pini A , Evan G. Induction of c-fos like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation［J］. Nature，1987，328∶632.

　　［5］Presley RW , Menetrey D , Levine JD , et al. Systemic morphine suppresses noxious stimulus-evoked Fos protein-like immunoreactivity in the rat spinal cord［J］. J Neurosci，1990， 10(1) ∶323.

　　［6］张亚军. Fos : 疼痛在分子水平的标志［J］. 国外医学麻醉学与复苏分册，1996，17 (4) :202.

　　［7］Henry JL. Effects of substance P on functionally identified units in cat spinal cord［J］. Brain Res，1976，114(3)∶439.

　　［8］Duggan AW ,Hendry IA ,Morton CR , et al. Cutaneous stimulireleasing immunoreactive substance P in the dorsal horn of the cat［J］. Brain Res， 1988，451(1-2)∶261.

　　［9］王 红，周晓巍，张 宏，等. 鞘内注射ω-芋螺毒素SO3对神经痛大鼠脊髓Fos及Jun蛋白表达的影响［J］.中国临床药理学与治疗学，2006，11（8）：892.

　　［10］Barber RP , Vaughn J E , Slemmon J R , et al. The origin , distribution and synaptic relationships of substance P axons in rat spinal cord［J］. J Comp Neurol，1979，184(2)∶331.

　　［11］王贤裕,杨 光.P物质在脊髓参与痛觉调控机制的研究进展［J］.国外医学麻醉学与复苏分册，2001，22：5.

　　［12］Brodin E , Linderoth B , Gazelius B , et al. In vivo release of substance P in cat dorsal horn studied with microdialysis［J］. Neurosci Lett，1987，76(3)∶357.