|
|
作者：刘少青 沈秀萍 迟玉友 尹洪山 李刚 苏庆国
【摘要】 目的 探讨蛋白激酶C(PKC)和热休克蛋白70(HSP70)在缺血预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的保护作用。方法 将大鼠随机分为对照组(CON)、缺血再灌注组(IR)和缺血预处理后缺血再灌注组(IPC)。除病理组织学变化外，用免疫组化检测各组中不同灌注时间的PKC和HSP70的变化。结果 病理组织学肾小管评分IPC组均低于IR组(P＜005)，而IPC组和CON组之间无显著性差异(P＞005)；PKC的表达IPC组明显高于IR组(P＜001)，并且在再灌注2 h和6 h时，IPC组中的表达明显高于CON组(P＜005)；HSP70的表达IPC组明显高于IR组(P＜001)，并且在再灌注2 h和6 h时，在IPC组中的表达明显高于CON组(P＜001)。结论 缺血预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤有保护作用，其保护机制可能与PKC的激活以及与HSP70的诱导合成增多有关。
【关键词】 肾脏；缺血预处理；缺血再灌注损伤；蛋白激酶C；热休克蛋白
【Ａbstract】 Ｏbjective To investigate the role of protein kinase C and HSP70 in the protecitve effect of ischemic preconditioning in rat renal damage of ischemiareperfusion.Ｍethods Rats were randomly divided into control group (CON),ischemiareperfusion group(IP) and ischemic preconditioning group(IPC).In different groups,desides pathological changes,the protein expression of protein kinase C(PKC) and HSP 70 were measured by immunohistochemistry.Ｒesults The score of renal tubules in IPC was lower than that in IR (P＜005)，and the score was similar between IPC and CON (P＞005)．The protein expression of PKC in IPC was higher than that in IR(P＜001)，and reperfused for 2 h or 6 h，the expression of HSP70 in IPC was higher than that in IR respectively(P＜001)，and reperfused for 2 h or 6 h,the expression of HSP70 in IPC was higher than that in CON (P＜001)．Ｃonclusion Ischemic preconditioning could protect the damage of ischemiareperfusion and the mechanism may be related to the activation of PKC,and may be related to more formation of HSP70.
【Key words】 renal ischemiareperfusion injury,ischemic preconditioning,protein kinase C,heat shock protein
自1986年Murry等［１］提出缺血预处理对心脏有保护作用以后，人们开始了通过各种预处理来调动脏器内源性保护作用的研究。最后，国内、外有人在这方面开始了对肾脏的观察，但对其机制未做进一步的报道。本研究的目的是通过免疫组化检测PKC和HSP70的变化，以及通过病理组织学变化来进一步证实缺血预处理对肾脏缺血再灌注损伤有保护作用，并探讨其可能存在的机制。
1 材料与方法
１．１ 实验动物 健康成年Wistar大鼠81只，购自延边大学医学院实验动物科，体重(23728±166)g，雌雄不限。
１．２ 实验方法
1．２．１ 将大鼠随机分为对照组(CON)、缺血再灌注组(IR)、缺血预处理后缺血再灌注组(IPC)，每组27只，每组再分为3个小组，每小组9只。IPC组连续3次缺血5 min后再灌注5 min，再缺血1 h，然后再灌注0、２、6 h取标本；对照组在游离出左肾蒂后，未做任何处理，但在切取左肾标本时要在时间上保持和IPC组相同。切取标本后，用中性福尔马林固定，制成石蜡切片，以备免疫组化和普通常规染色用。
1．２．２ 组织中PKC蛋白的检测：采用免疫组化(SABC)染色方法。PKC和HSP70抗体购自Santa Cruz公司，SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，实验按试剂盒说明书进行，略加修改，石蜡包埋切片，行抗原微波修复，一抗用抗体释放液1∶100稀释。用已知的阳性标本作阳性对照，用生理盐水代替一抗作用阴性对照。
1．２．３ 结果判断：选取切片平展、细胞形态和组织结构清晰的组织切片进行分析。在光镜下观察，于病变严重处，在400倍光镜下观察，每个视野选择10个肾小管评分，按50个肾小管计分(即5个视野)，其标准依据Paller氏法［２］：肾小管明显扩张，细胞扁平1分，刷状缘损伤或脱落1分或2分，管型2分，肾小管腔内有脱落的坏死细胞未形成管型或碎片1分。PKC蛋白表达于肾小管上皮细胞的细胞膜和细胞浆，呈棕黄色为阳性，PKC和HSP70免疫组化检测结果在400倍光镜下观察，随机选5个视野，计算阳性细胞和总细胞数，计算出阳性细胞率，然后按如下计分：无阳性细胞为阴性(0分)，阳性细胞在25%以下为弱阳性(2分)，25%～５０％为阳性(4分)，50%以上为强阳性(6分)。因PKC在肾小管上皮细胞的细胞膜和细胞浆中均有表达，而PKC只有在与细胞膜结合时，才能发挥其最大生物效应，因此只要PKC在细胞膜中表达，即判为阳性。
１．３ 统计学处理 用t检验进行统计学处理。
２ 结果
21 肾小管评分，在0、2、6 h各不同时间，IPC组均低于IR组(Ｐ＜005),CON组也明显低于IR组(P＜001或P＜005)，而IPC组和CON组之间无显著性差异(P＞005)，见表1。
表1 各组大鼠肾脏光镜下肾小管评分（略）
22 PKC的表达中，IPC组显著高于IR组(P＜001)；在2 h和6 h，IPC组高于CON组(P＜005)，而在0 h时，两组之间无显著性差异(P＞005)；IR组和CON组之间无显著性差异(P＞005)，见表2。
表2 各组大鼠肾脏组织中PKC表达的半定量评分（略）
23 ＨＳＰ70的表达中，IPC组明显高于IR组(P＜001)，并且在再灌注2 h和6 h时，在IPC组中的表达明显高于CON组(Ｐ＜001)，见表3。
表3 各组大鼠肾脏组织中HSP70表达的半定量评分（略）
24 在IPC组中，HSP70蛋白和PKC蛋白的表达呈一致性(P＞005)，见表4。
表4 IPC组中HSP70和PKC的表达 略
3 讨论
缺血预处理对肝、肾和心脏等缺血再灌注损伤有保护作用已成共识，我们的实验得出了相一致的结果。从形态上看，缺血预处理组再灌注2 h和6 h的肾脏明显好于缺血再灌注组。光镜下见缺血再灌注组肾小管上皮细胞明显水肿样变性，肾小管的刷状缘脱落或部分脱落，以近曲小管为重，并见管型，肾间质局部出血伴水肿；缺血预处理组仅见部分肾小管上皮细胞轻度水肿样变性，偶见管型。从表1肾小管评分可以看出，缺血预处理组明显优于缺血再灌注组(P＜005)，而缺血预处理组与对照组之间无显著性差异(Ｐ＞005)。缺血预处理的机制极为复杂，有大量假说在各种动物模型上已被证实。如细胞cAMP生成减少，线粒体ATP酶抑制，腺苷生成，儿茶酚胺生成，缓激肽生成，氧自由基生成减少，蛋白激酶C激活，热休克蛋白合成增多，丝裂素活化蛋白激酶激活等［３］
在不同的实验方法、动物种属中，缺血预处理的机制都会不同，对于同一种动物不同的脏器，机制也不同，缺血预处理对肾脏的保护作用中，可能只有上述的某些因素参入。从我们的实验结果看，PKC和HSP70参入了肾脏的缺血预处理的保护过程中。PKC是一类依赖于Ca2+、乙酰基甘油或磷酯酰丝氨酸刺激而激活，催化蛋白质内丝氨酸／苏氨酸残基磷酸化的蛋白激酶，是细胞肌醇磷脂信号通路的关键环节，在细胞生长功能上起着重要的作用。从本研究资料表2看出，在PKC的表达中，IPC组明显高于IR组(P＜001)，在2 h和6 h时，IPC组中PKC的表达也高于CON组(P＜005)，这说明在IPC过程中，PKC的激活介导了大鼠肾脏的缺血预处理的保护作用；同时也看到了在正常肾脏组织中，PKC就有一定水平的表达，在缺血预处理作用下，PKC的活性进一步的增加，促使缺血再灌注损伤得以修复。这与王欣等［４］和乌立晖等［５］的结果相一致。其作用机制可能是：短暂缺血可以促使某些内源性物质释放，这些物质包括儿茶酚胺、氧自由基、腺苷等，它们作用于细胞膜上的特异性受体，通过G蛋白的介导，激活磷脂酶C或D，使磷酸磷脂酰肌醇二磷酸或肌醇磷脂胆碱水解，引起二酰基甘油生成及细胞内Ca2+浓度增高，从而激活PKC［６］。PKC激活后产生的保护作用是某些效应蛋白磷酸化的结果。ATP依赖的钾通道、5′核苷酸酶、热休克蛋白和丝裂素活化蛋白激酶等有可能成为PKC的底物，介导缺血预处理的保护作用［７］。从这一方面看，PKC起着关键重要的作用。从以上分析可以看出，PKC的激活引起了HSP70的增多，增多的HSP70伴随肾脏对缺血及氧化损伤的抵抗力增加。近年来，有文献报道［８］，热休克预处理中产生的HSP70能抑制核转录因子кв（ＮＦкв）的活化，进而阻断促炎因子的表达。ＮＦкв广泛存在于真核细胞内，是将信息从细胞浆传到细胞核，引起相应基因表达的主要转录因子，静息情况下，ＮＦкв位于细胞浆内与кв抑制蛋白(inhibitor кв，Iкв）结合成复合物处于失活状态，Iкв有多种构成形式，Iкв a/MAD３是最能表现其分子生物学功能的形式，细胞受到刺激后，Iкв a磷酸化，并被降解，从NFкв／Ｉкв a复合物上解离下来，NFкв遂即通过核膜上的受体进入细胞核与靶基因кв位点结合，迅速诱导靶基因的转录。NFкв调控着诸多参入免疫、炎症反应因子的表达，因此热休克蛋白通过抑制ＮＦкв与受体结合，进而阻断促炎因子的表达［9］。从本实验结果表3中看出，IPC组中，HSP７０在0 h的表达稍有增高，与IR组比较有显著性差异(P＜005)。而在2 h、6 h时，HSP70的表达，IPC组明显优于IR组和CON组(P＜001)，这与Knowlton等［１０］和Das等［１１］的报道结果一致，这说明缺血预处理可通过诱导HSP70的合成增多，从而阻断促炎因子的表达而对肾脏缺血再灌注损伤起保护作用。从表4中可以看出，HSP70蛋白和PKC蛋白的表达呈一致性，这说明HSP70蛋白和PKC蛋白均参入了鼠肾脏缺血预处理的保护作用过程中；同时也说明了缺血预处理激活PKC，PKC激活后作用于底物热休克蛋白和丝裂素活化蛋白激酶等，从而介导缺血预处理的保护作用，这与上述机制［６，７］相吻合。从这里看，缺血预处理对大鼠肾脏的保护作用是多因素参与的结果。
【参考文献】
［１］ Murry CE,jenings RB,Reimjer KA,et al.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［Ｊ］．Circulation,1986,74(5):1124１１３６
［２］ Paller MS.Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat［J］.J Clin Invest,1984;74:1156
［3］ Paller JR.Possibilities for the pharmacological exploitation of ischemic preconditioning［J］.J Mol Cell Cardiol,1995,24:9911000
［4］ 王欣，杨学萍，李玉光，等．蛋白激酶C在缺血预处理限制心肌梗死范围效应中作用的观察［J］．中国危重病急救医学，1999，11(7)：627６３０
［５］ 乌立晖，张宝仁，朱家磷，等．缺血预处理对大鼠心肌细胞超微结构的保护作用［Ｊ］．第二军医大学学报，1998，19(2)：159161
［６］ Yang XM,Sato H,Downey JM.Protection of ischemic preconditioning is dependent upon a critical timing sequence of protein kinase C action［Ｊ］．Ｊ Mol Cell Cardiol,1997,29：１４３１５１
［７］ Millar CGM,Baxter GF,Thiemerman C.Protection of the myocardium by ischemic preconditioning:mechanisms and therapeutic implications［Ｊ］．Ｐharmacol Ther,1996,69:143１５１
［８］ Wang HR,Ryan M,Mestri R.The heat shock response inhibits inducible nitric oxide synthase gene expression by blocking Iкв degradation and NFкв nuclear translocation［Ｊ］．Ｂiochem Biophs Res Common,1997,231:257
［９］ Baldin AS Jr.The NFкв and Iкв proteins:New discoveries and insights［Ｊ］．Ａnnu Rev Immunol,1996,14:649
［１０］ Ｋnowlton AA,Brecher P,Apstein CS.Rapid expression of heat shock protein in the rabbit after brief cardiac ischemia［Ｊ］．Ｊ Clin Invest,1991,87:139
［１１］ Das DK,Engelman RM,Kimura Y.Molecular adaptaition of cellar defences following preconditioning of the heart by repeated ischemia［Ｊ］．Ｃardiovasc Res,1993,27：５７８ |
|
|Archiver|手机版|小黑屋|魅优论文范文网
( 琼ICP备10200388号-7 )
发表于 2014-4-11 15:13:48
收藏
转播
支持
反对