墨旱莲对胸腺细胞凋亡影响的研究

jz066520 · 发表于 2014-6-1 22:23:40

         作者：庄晓燕杨菁王怡薇景辉白秀珍

【摘要】  目的：研究墨旱莲水煎剂对不同药物诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型细胞凋亡的影响。方法：制作以环磷酰氨诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型和以氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型;用不同浓度的墨旱莲水煎剂对其治疗，用电镜或荧光显微镜观察其形态变化;用流式细胞仪等检测胸腺细胞凋亡情况。结果：以环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型组小鼠和以氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型组小鼠，胸腺均出现典型细胞凋亡表现;用不同浓度的墨旱莲水煎剂对其治疗，均使细胞凋亡情况得到一定抑制，且有计量依赖性。环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.15%;环磷酰氨组胸腺细胞亡凋率30.25%;各治疗组(3～7组)依次分别是28.76%、26.14%、12.06%、3.24%、3.6%。氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型组，流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.33%;氢化可的松组胸腺细胞亡凋率22.78%;墨旱莲各组(2～4组)依次分别是2.33%、2.31%、2.31%;治疗各组(6～8组)分别是16.52%、9.74%、4.26%。结论：环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功;氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功。墨旱莲水煎剂可以抑制以环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡，也可以抑制氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡，而对正常细胞几乎没有影响。故墨旱莲水煎剂对小鼠免疫功能有调节作用。

【关键词】  墨旱莲; 环磷酰胺; 氢化可的松; 小鼠; 胸腺; 细胞凋亡

墨旱莲为菊科植物鳢肠的干燥地上部分。墨旱莲很早就应用于临床，有扶正固本、滋补肝肾、凉血止血的功效[1]，主要用于出血性疾病、牙齿松动、须发早白、阴虚血热、肝肾亏损等。本研究探讨墨旱莲对以环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡和以氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的免疫调节作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　昆明种小鼠，3～4周龄，体重18～22g，雌雄各半，150只，由辽宁医学院实验动物中心提供。

　　1.2 药品和试剂

　　墨旱莲干燥全草，购自锦州市成大方圆药店，制成浓度为1g/ml的水煎剂。磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)的配制：Nacl 4g、Kcl 0.1g、KH2PO4 0.1g、Na2HPO3，12H2O 1.442g三蒸水定容至500ml，4℃保存。吖啶橙染色液的配制：吖啶橙10mg溶于10mlPBS中(PBS的pH<3)4℃保存。碘化丙啶染色液的配制：取碘化丙啶5mg、RNaseA 5mg、枸橼酸钠100mg、曲拉通-1001ml，加65ml生理盐水完全溶解后，用三蒸水定容至100ml，4℃避光保存。环磷酰胺(上海第二制药厂 );氢化可的松(齐齐哈尔第二制药厂);RNA酶A(华美公司);其他试剂均为国产分析纯。

　　1.3 主要仪器

　　透射电子显微镜(日本JEM1200EX型);超薄切片机;(日本LKB5型);流式细胞仪(美国B.D公司FACScan Cell Quest分析系统);高速冷冻离心机(TGLL18G型)等。

　　1.4 动物模型的制作

　　1.4.1 环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型的制作：将70只小鼠隋机分成7组，正常对照组、环磷酰胺组、5个墨旱莲治疗组(简称治疗组)，每日每公斤体重分别给墨旱莲2g、4g、8g、16g、25g，连续6d以墨旱莲水煎剂灌胃;正常对照组腹腔注射生理盐水;环磷酰胺组和各治疗组第4天腹腔注射环磷酰胺50mg/Kg体重。

　　胸腺细胞悬液的制备：末次给药24h后，颈椎脱位法处死小鼠，取胸腺于平皿内用PBS清洗干净，用眼科剪剪碎，过200目筛网制成细胞悬液，置离心管中，800～1000r/min离心10min。用0.01mol/L的PBS重悬细胞，即为胸腺细胞悬液。

　　胸腺细胞凋亡的形态学观察：将胸腺细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中，2000r/min离心15～20min，使细胞成团;小心吸去上清加入2.5%戊二醛固定液固定细胞团。取出琼脂，切下含有细胞团的琼脂块。将含有细胞团的琼脂块投入装有戊二醛固定液的小瓶中，4℃保存。用0.1mol/L的PBS洗1次，1%锇酸后固定30～60min。用超薄切片机切片，加醋酸铀染色30min，用透射电镜观察、拍照。

　　凋亡细胞的检测：依上法制备胸腺细胞悬液，调整细胞数为1×107/ml;用3mlPBS洗1次，1000r/min离心10min，去PBS;加入预冷的70%乙醇固定，4℃放置24h;1000r/min离心10min，去固定液;3mlPBS重悬5min，1000r/min离心10min，去PBS;加入1ml碘化丙啶染色液，4℃避光放置30min;流式细胞仪检测。

　　1.4.2 氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型的制作：将80只小鼠随机分成8组：1组为正常对照组;2～4组为墨旱莲组，每日每公斤体重分别给墨旱莲5g(低剂量组)、10g(中剂量组)、15g(高剂量组);5组为氢化可的松组;6组为氢化可的松墨旱莲低剂量组，简称治疗1组;7组是氢化可的松墨旱莲中剂量组，简称治疗2组;8组是氢化可的松墨旱莲高剂量组，简称治疗3组。2～4组、6～8组连续6d以墨旱莲水煎剂灌胃;1组和5组以等量生理盐水灌胃;5～8组在第1、3、5天腹腔注射氢化可的松30mg/kg体重，1～4组腹腔注射等量生理盐水。

　　胸腺细胞悬液的制备：末次给药24h后，依上法处死小鼠，制作胸腺细胞悬液。

　　胸腺细胞凋亡的形态学观察：调整细胞数为1×107/ml;取95ul细胞悬液，加入5ul吖啶橙染色液，混匀;吸取混合液滴在载波片上，加盖盖玻片;荧光显微镜400倍镜下观察并拍照。

　　凋亡细胞的检测：依上法用流式细胞仪检测。　2 结果

　　2.1 两种小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功

　　2.1.1 环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功

　　在电镜下观察正常对照组小鼠胸腺细胞呈圆形或椭圆形，核大，异染色质丰富。环磷酰胺组胸腺细胞体积缩小，细胞膜完整，胞浆浓缩，细胞电子密度增加，染色质凝集，在核膜周边形成新月形或花瓣状团块，核膜光滑完整[2]。

　　2.1.2 氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功

　　在荧光显微镜下观察结果，正常对照组小鼠胸腺细胞呈圆形或椭圆形，胞浆呈均匀的绿色荧光，细胞核较大，呈均匀的黄绿色荧光(图1)。5组即氢化可的松组小鼠胸腺细胞可见大量的凋亡细胞。典型的凋亡细胞呈不规则形核固缩，染色质向核膜靠拢呈新月状或花瓣状，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光区，说明氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功(图2)。

　　2.2 墨旱莲水煎剂对两种小鼠胸腺细胞凋亡模型均有治疗作用

　　2.2.1 墨旱莲水煎剂对环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的调节作用在电镜下观察到各治疗组与环磷酰胺组比较，小鼠胸腺细胞凋亡数量明显减少，且随着墨旱莲水煎剂用量的增加凋亡细胞减少的越多，其中以6组(16g/Kg)最好，细胞与正常对照组几乎没有区别。而7组(25g/Kg)较6组细胞凋亡数有所增加。流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.15%;环磷酰胺组胸腺细胞亡凋率30.25﹪;各治疗组(3～7组)依次分别是28.76%、26.14%、12.06%、3.24%、3.6%。

　　2.2.2 墨旱莲水煎剂对氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的调节作用在荧光显微镜下观察结果，墨旱莲各组(2～4组)与正常对照组比较，小鼠胸腺细胞凋亡情况无有区别。治疗各组(6～8组)与氢化可的松组比较，小鼠胸腺细胞凋亡数量明显减少，且随着墨旱莲水煎剂用量的增加凋亡细胞减少的越多，其中以8组(15g/Kg)最好，与正常对照组几乎没有区别(图3)。

　　流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.33%;氢化可的松组胸腺细胞亡凋率22.78%;墨旱莲各组(2～4组)依次分别是2.33%、2.31%、2.31%;治疗各组(6～8组)分别是16.52%、9.74%、4.26%。

　　3 讨论

　　细胞凋亡又叫程序性死亡，是细胞通过基因调控，遵循自身规律，程序性的结束生命，是一种与坏死截然不同的死亡方式。如成熟的淋巴细胞和其他成熟的白细胞寿命只有1天，死一批再生一批相互交替，非常严格有序。若细胞凋亡发生障碍，只生不死，就会出现白细胞堆积，发生白血病。细胞凋亡是保证多细胞生物个体正常发育成熟和维持正常生理过程所必须的。细胞凋亡过程失调不仅可使生物个体失去机体的稳定性，还是许多人类严重疾病的根源[3]。环磷酰胺是临床常用的氮芥类免疫抑制剂，具有细胞毒性，可以引起细胞凋亡[4]。故利用环磷酰胺诱导小鼠胸腺细胞凋亡，制作细胞凋亡模型。从电镜观察结果可见正常对照组小鼠胸腺细胞呈圆形或椭圆形，核大，异染色质丰富。环磷酰胺组胸腺细胞体积缩小，细胞膜完整，胞浆浓缩，细胞电子密度增加，染色质凝集，在核膜周边形成新月形或花瓣状团块，核膜光滑完整，具有凋亡细胞的特征。流式细胞仪是定性、定量检测细胞凋亡的重要指标，从检测结果可见，正常对照组胸腺细胞凋亡率2.15%;环磷酰胺组胸腺细胞凋亡率高达30.25%。因此，无论从形态学观察结果还是流式细胞仪检测结果都说明环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功。氢化可的松是糖皮质激素类药物，具有抗炎抗毒、抗休克和免疫抑制作用。本研究利用它的免疫抑制作用，制作细胞凋亡模型。因为氢化可的松进入胸腺细胞后，可以激活胞浆受体，变构后进入细胞核，与DNA反应元件结合，引起基因转录的抑制或诱导，从而使细胞凋亡，故用氢化可的松作为诱导剂制作胸腺细胞凋亡模型[5]。从图1可见正常胸腺细胞呈圆形，胞核较大，呈均匀的黄绿色荧光，胞浆稀少，呈均匀的绿色荧光。从图2可见，5组即氢化可的松组小鼠胸腺细胞可见大量的凋亡细胞。典型的凋亡细胞呈不规则形核固缩，染色质向核膜靠拢呈新月状或花瓣状，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光区。流式细胞仪检测结果可知，正常对照组胸腺细胞凋亡率2.33%;氢化可的松组胸腺细胞亡凋率22.78%。所以从形态学观察结果和流式细胞仪检测结果均说明氢化可松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功。

　　墨旱莲水煎剂对氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡有调节作用。在荧光显微镜下观察结果，墨旱莲各组(2～4组)与正常对照组比较，小鼠胸腺细胞凋亡情况几乎没有区别。流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.33%，墨旱莲各组(2～4组)依次分别是2.33%、2.31%、2.31%;说明墨旱莲对正常胸腺细胞几乎没有影响。由图3可见治疗组(8组)凋亡细胞数量与氢化可的松组(2组)比较已明显减少，细胞形态已基本恢复正常胸腺细胞的形态(图3)。流式细胞仪检测结果，治疗组(6～8组)胸腺细胞凋亡率依次是16.52%、9.74%、4.26%，说明墨旱莲水煎剂对氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡有抑制作用，并且有计量依赖性。

　　从环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的形态学情况可见，随着墨旱莲水煎剂用量的增加胸腺细胞凋亡的数量减少，且细胞形态越接近正常对照组，说明墨旱莲水煎剂对环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡有抑制作用，并且有计量依赖性。其中以6组(16g/Kg)最好。7组(25g/Kg)墨旱莲水煎剂用量虽然增加，但抑制作用并没有增加，反而有所下降。说明墨旱莲水煎剂只有在低浓度时有计量依赖性，其抑制作用有一个最佳浓度，超过这个浓度，抑制作用反而减弱。

　　综上所述，环磷酰胺和氢化可的松均可以诱导小鼠胸腺细胞凋亡。墨旱莲水煎剂对上述两种模型的胸腺细胞凋亡均有抑制作用;在浓度较低时，随着浓度的增加抑制作用也增加，具有计量依赖性;增加到一定浓度时可以达到最大抑制;此后再增加浓度，其抑制作用不仅不会增加，反而还会下降。说明墨旱莲其药物作用的发挥有最佳浓度值。目前在国际和国内医学界，细胞凋亡都是疾病研究的热点。因为细胞凋亡涉及生命活动中的众多领域及机体许多病理生理过程，如胚胎发育、造血、免疫、肿瘤、T淋巴细胞介导的细胞毒性作用等。临床上大剂量的激素应用可诱导病理性免疫细胞凋亡，导致免疫损伤。细胞凋亡的失常与自身免疫性疾病、肿瘤、感染性疾病、机体衰老等许多疾病的发生发展有密切关系，故胸腺细胞凋亡的研究，不仅有利于免疫活性细胞发育、免疫耐受形成机制等免疫学问题的认识，而且随着细胞凋亡机制的深入研究，人们可以通过干预胸腺细胞凋亡，保护胸腺细胞及提高免疫功能，为临床上的免疫缺陷、重症感染等的治疗提供新的思路。

　　墨旱莲是传统的中草药，在临床作为止血药等已广泛应用。本研究通过制作小鼠胸腺细胞凋亡模型，了解到墨旱莲对胸腺细胞凋亡有抑制作用，这无疑扩大了墨旱莲在临床的应用。但墨旱莲的哪些成分在起作用，尚有待进一步探讨。

【参考文献】
  　1 《全国中草药汇编》编写组. 全国中草药汇编，人民卫生出版社，1976，453.

　　2 景辉，白秀珍，杨学东，等.墨旱莲对小鼠胸腺细胞凋亡的调节作用.数理医药学杂志，2005，18(4)：318～320.

　　3 刘雪英，赵越平.墨旱莲乙酸乙酯总提取物对小鼠免疫功能的调节作用.中药材，2000，23(7):754.

　　4 Castteel K，Waer M，Bouillon R，etal.25Dihydroxyvitamin D3 restores sencitivity to cyclophosphamideinduced apoptosis in nonobese diabetic(NOD)mice and protects against diabetes.Clin Exp Immunol，1998，112(2)：181.

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