眼睑基底细胞癌组织中Survivin的表达及统计分析

jz066520 · 发表于 2014-6-1 22:26:47

【摘要】  目的：探讨眼睑基底细胞癌组织中Survivin的表达。方法:收集武汉市中心医院和武汉大学中南医院病理科2002～2009年手术切除及活检的眼睑基底细胞癌( basalcell carcinoma,BCC)标本共20例，另取癌周围正常组织5例作对照。将眼睑基底细胞癌和正常组做免疫组织化学染色，观察各组细胞内Survivin的表达。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对Survivin在各组中的表达进行定量分析。结果：眼睑基底细胞癌组织中Survivin呈高表达，癌旁组织中Survivin呈低表达。图像分析结果显示眼睑基底细胞组织与癌旁组织之间Survivin的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性(P<0.01)。结论：Survivin在眼睑基底细胞癌中的异常表达，对眼睑基底细胞癌的发生发展起了重要作用。

【关键词】  眼睑; 基底细胞癌; Survivin; 统计分析

　眼睑基底细胞癌(basalcell carcinoma,BCC)是最常见的眼睑恶性肿瘤，约占眼睑恶性上皮性肿瘤的85%～95%[1]。研究显示多种癌基因的异常表达在眼睑BCC的发生发展过程中有重要作用，研究癌相关基因抗原在BCC发生、发展及转移机制中的作用，对于揭示BCC的生物学行为及探索有效的防治方法有重要意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本来源收集武汉市中心医院和武汉大学中南医院病理科 2002 ～ 2009 年手术切除及活检的眼睑基底细胞癌( basalcell carcinoma,BCC)标本共20例，另取癌周围正常组织5例作对照。所有标本均经10%甲醛固定, 常规HE染色，光镜观察，病理检查确诊。

　　1.1.2 主要试剂即用型鼠抗人Survivin单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新生物有限公司);DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.1.3 主要仪器 YWY781型医用微波仪，250W，50Hz，浙江临安电子器材厂生产;家用高压锅。

　　1.2 方法

　　1.2.1 常规HE染色取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。

　　1.2.2 免疫组织化学SP法检测Survivin抗原主要步骤： ① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;④正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(Pp 7.4)漂洗3×3 min;⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应; ⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.3 免疫组织化学结果判断

　　Survivin抗原以细胞浆或胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，细胞浆或胞核内无棕黄色反应物。

　　采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对细胞浆或胞核的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

　　1.4 统计学处理

　　数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5 软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。

　　2 结果

　　2.1 HE染色

　　瘤体由基底样细胞组成，细胞核大，呈圆形或椭圆形，胞浆为嗜碱性，可见少量核分裂相。瘤体周边细胞呈栅栏状排列。肿瘤周围结缔组织增生，有较多纤维母细胞，产生胶原纤维包绕在瘤体周围。

　　2.2 Survivin的表达

　　基底细胞癌组织中可见癌细胞胞浆内棕黄色颗粒较多，Survivin表达呈阳性;癌旁组织的细胞胞浆内可见极少量的棕黄色颗粒，Survivin表达呈阴性。图像分析结果显示：眼睑基底细胞癌Survivin表达的平均光密度为0.3853±0.0254，癌旁组织Survivin表达的平均光密度为0.0246± 0.0029; 眼睑基底细胞癌Survivin表达的阳性面积率为0.3520±0.0263;癌旁组织中Survivin表达的阳性面积率为0.0305±0.0021。经单因素方差分析，组间有显著性差异(P<0.01﹚。经q 检验，眼睑基底细胞癌与癌旁组织之间，Survivin的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P<0.01﹚见表。表1 基底细胞癌与癌旁组织Survivin表达的平均光密度和阳性面积率

　　3 讨论

　　基底细胞癌是眼睑最常见恶性肿瘤，常发生于长期暴露于阳光下的中年以上的人群，男性略多，好发于下睑及内眦，病变位置表浅， BCC 是生长缓慢的肿瘤,病程一般较长, 最长可达20年。BCC一般只局部侵袭, 很少转移, 但若不及时治疗, 肿瘤可侵及眼轮匝肌、睑板和眶骨, 并可经眼眶向颅内侵犯。近年来随着人口的高龄化, BCC有逐渐增多的趋势[2，3]。

　　人Survivin基因位于17号染色体端粒部位,基因总长度14. 7KB,包含4个外显子和3个内含子。Survivin作为IAP家族中最小的1个新成员,结构独特。它只含有1个B IR结构,该结构被认为是Survivin发挥抗凋亡作用的部位[5～7]。目前普遍接受的观点是, Survivin作用于各个凋亡途径的汇集点: 直接抑制终末效应蛋白caspase9、caspase3和caspase7。最新发现Smac分子是与细胞色素C同时从线粒体释放出来的具有拮抗IAP 作用的蛋白小分子, 它是通过其NH2 末端与IAP分子结合而抑制后者的功能。受Smac分子作用的启发,大量的工作致力于发现能与IAP结合的非肽类小分子化学物质,这些小分子能够通过模拟Smac分子的作用而诱导肿瘤细胞凋亡[8～10]。

　　Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，Survivin具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关[11]。现已发现，Survivin在所有常见恶性肿瘤中表达，如乳腺癌、胃癌、肾癌、黑色素癌、肠癌、神经母细胞癌和卵巢癌等，而在正常组中无表达。它的这一特性，使得靶向Survivin的免疫治疗和基因治疗能够促进肿瘤细胞的凋亡，抑制其增殖，正常组织却能不受损伤和影响。Survivin可以作为抗肿瘤免疫治疗的一个广泛适用的靶基因[12～15]。　　实验采用免疫组织化学方法观察了Survivin在眼睑基底细胞癌组织和癌旁组织中的表达，实验表明眼睑基底细胞癌与癌旁组织之间，Survivin的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P<0.01﹚，Survivin做为新的抗凋亡基因与肿瘤细胞的增殖与血管生成密切相关。

　　目前，关于Survivin在肿瘤中的研究已经取得了一定的进展，但是还有不少方面需要更深入地进一步研究。如Survivin与肿瘤发生发展及其临床预后的相关性，Survivin在细胞浆和细胞核中的表达受到何种调节，Survivin的各种异构体之间的关系及作用，以及Survivin在肿瘤靶向治疗中的作用等都需要我们去探究。

【参考文献】
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　　4 Saari KM,Paavilainen V,Tuominen J,et al. Epidemiology of basal cell carcinoma of the eyelid in southwestern Finland.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2001，239(3):230～233.

　　5 Montironi R,Mazzucchelli R,Stramazzotti D,et al. Basal cell hyperplasia and basal cell carcinoma of the prostate:a comprehensive review and discussion of a case with cerbB2 expression.J Clin Pathol,2005，58 (3):290～296.

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　　10 Ryan B ,O'Donoban N ,Browne B , et al. Expression of survivin and itssplice variants survivin22B and survivin2 △Ex3 in breast cancer. Br JCancer ,2005 ,92 (1) :120～124.

　　11 Tanaka K,Iwamoto S ,Gon G, et al. Expression of survivin and

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