锌和维生素E对Ⅰ型糖尿病大鼠心肌凋亡促进因子Smac表达的作用

jz066520 · 发表于 2014-6-2 10:27:05

【摘要】  目的：探讨锌和维生素E对Ⅰ型糖尿病大鼠心肌凋亡促进因子Smac表达的作用及对糖尿病大鼠心肌细胞保护作用的机制。方法：按体重将大鼠随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只),实验组动物采用腹腔注射链脲左菌素(streptozotocin， STZ)，60mg/kg一次注射，制备糖尿病大鼠模型。将40只实验组大鼠按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn+VE组。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学染色,观察各组心肌组织Smac的表达水平, 利用HPIAS2000图像分析系统测定Smac在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内Smac呈阴性表达, 糖尿病对照组心肌细胞内Smac呈阳性表达;糖尿病补锌组和糖尿病补VE组心肌细胞内Smac呈弱阳性表达;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞内Smac呈阴性表达。图像分析结果显示：糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间Smac的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05);糖尿病补Zn+VE组与正常组之间Smac的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。结论： Zn和VE联合使用可减低糖尿病导致大鼠心肌细胞凋亡的作用。

【关键词】  锌; 维生素E; 糖尿病; 心肌; Smac; 统计分析

糖尿病是一种常见的具有遗传倾向的葡萄糖代谢和内分泌障碍,是由于绝对性或相对性胰岛素分泌不足引起的。近半个世纪来,糖尿病患病率和死亡率有明显上升趋势,在我国已成为继心血管疾病、肿瘤之后列第3位的常见病、多发病和慢性非传染性疾病[1]。糖尿病在病理组织形态上主要是由于胰岛损伤,胰岛素绝对或相对缺乏所引起。近年来,国内外许多学者经过临床和流行病学调查,以及周密设计的基础研究和实验研究,虽然对糖尿病的病因有了较多的认识,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚[2～3]。

　　Smac是王晓东等2000年在线粒体中发现的一种蛋白,可释放到胞浆中促进凋亡的发生细胞凋亡和增殖的平衡是生物个体正常生长发育的基础,细胞增殖过度和(或)细胞凋亡受阻是肿瘤形成过程中的重要机制。Smac是近期发现的一种促凋亡蛋白,在凋亡信号刺激下与细胞色素C(cytc)一同从线粒体中释放,可通过结合并活化apaf1以及结合并解除凋亡抑制蛋白(IAPs)对caspase3、7、9的抑制作用而发挥作用[4～6]。

　　Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其含量的增加势必有利于这些酶活性的提高。Zn 对细胞保护作用的途径之一,是基于控制过氧化作用。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用[7]。锌和维生素E是抗氧化剂并具有细胞保护作用。

　　本研究应用免疫组织化学方法观察了锌和维生素E联合应用对高血糖引起的心肌细胞凋亡的保护作用，旨在探讨两者对糖尿病大鼠心肌的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1 材料

　　昆明种SD大鼠50只,雄性,体重180～200g ,武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1w后进行实验。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型建立及分组按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/ L、pH 4.4 的枸橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾静脉血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ L ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。将选取糖尿病大鼠40只按血糖值参考体重分为4组:糖尿病对照组,糖尿病补锌组,糖尿病补VE组,糖尿病补Zn+VE组。各组动物均喂饲人工合成饲料,配方:酪蛋白20 % ,玉米淀粉65% ,植物油8% ,纤维素1% ,混合维生素1% ,混合无机盐5%。混合维生素和无机盐配方参见文献[5],合成饲料控制锌浓度为20mg/kg。正常对照组和实验组给予去离子水;补Zn 组给予Zn 浓度为20 mg/L的含ZnSO4·7H2O 去离子水;补VE 组每天以50 mg/ kgVE 灌胃;Zn和VE联合补充组在给予Zn浓度为20mg/L的含ZnSO4 ·7H2O 去离子水的同时以50mg/ kgVE灌胃。实验期间,密切观察动物进食和饮水量变化,每周称两次体重,6周后将各组大鼠处死,切取心室壁肌组织,进行免疫组织化学实验观察。

　　1.2.2 主要试剂

　　① 即用型兔抗鼠Smac单克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司);② 超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);③ DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.2.3 免疫组织化学SP法检测Smac相关抗原

　　主要步骤：① 组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗;② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min;③ 切片采用微波抗原修复(3档，10 min)，PBS洗4×5min;④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应;⑤ 一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min;⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应;⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.2.4 免疫组织化学结果判断

　　以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。

　　采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对Smac的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。

　　1.2.5 统计学处理

　　对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准α为0.05。

　　2 结果

　　正常对照组心肌细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，Smac表达呈阴性, 糖尿病对照组心肌细胞胞浆内可见较多的棕黄色颗粒, Smac表达呈阳性;糖尿病补锌组心肌细胞核和胞浆内可见一些棕黄色颗粒, Smac表达呈弱阳性，糖尿病补VE组结果与糖尿病补锌组相同;糖尿病补Zn+VE组心肌细胞核和胞浆内可见少量的棕黄色颗粒, Smac表达呈阴性。图像分析结果显示见表1。糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间Smac的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05);糖尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补VE组之间Smac的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)，见表1。表1 糖尿病补Zn+VE组、糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组Smac表达的平均光密度和阳性面积率注： ☆ 正常对照组与糖尿病对照组比较，P<0.05 ;☆☆ 糖尿病对照组与糖尿病补Zn+VE组比较，P<0.05。

　　3 讨论

　　糖尿病是由于胰岛素分泌或作用的障碍，导致以高血糖为共同特征的内分泌代谢性疾病。急性并发症如：酮症酸中毒、高渗性酸中毒、高渗性昏迷;慢性并发症如：糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、皮肤病变;神经病变如：周围神经病变、植物神经病变等;还有急性、慢性、局部和全身的感染如：皮肤坏疽、肺结核、胆囊炎、胆结石、肾孟肾炎、外阴感染。糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症。据流行病学调查估计目前全球糖尿病患者总数已逾一亿，其中90%左右为2型糖尿病，其发病机理为胰岛素抵抗为主伴有胰岛素分泌缺陷或胰岛素分泌缺陷为主伴胰岛素抵抗和肝脏葡萄糖产生增加。2型糖尿病的治疗以口服降糖药为主。糖尿病是一种严重威胁人们健康的慢性疾病[8～10]。　细胞凋亡(Apop tosis)又称程序性细胞死亡( Programmed cell death) ,是生理性细胞死亡过程,对机体的发生、发展,以及自身稳定起着关键性作用。Smac是一种新发现的线粒体蛋白,在细胞凋亡过程中起着重要作用;当细胞发生凋亡时,其与细胞色素C一起被释放进入细胞浆[11]; Smac 通过解除凋亡抑制蛋白对Caspase3、Caspase7、Caspase9的抑制作用而诱导细胞凋亡。Smac能引发保护性的细胞反应而不致细胞死亡。体外培养研究结果表明, Smac可引起人类主动脉平滑肌细胞和内皮细胞的活化,增生。对MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)路径的分析揭示, ERK1、JNK1 ( JunN末端激酶)和MAPK等激酶都被Smac活化。内皮细胞膜上的Smac也能够活化JAK1 (Janus激酶)以及信号转导因子和转录激活因子STAT3, 4,进而启动一些相关基因的表达。现有证据证明:补体系统的活化在动脉粥样硬化的慢性炎症进展中,起着重要作用[12]。利用新西兰白兔离体心脏研究表明:非杀伤性补体激活,能够显著减少因局部缺血造成的梗死面积;但结果提示,这种情况下补体是通过C5a的形成而起作用的。进一步研究提示,由免疫球蛋白介导的补体缓慢活化而产生的Smac对充血性心肌病的发展,可能起着一定程度的促进作用。经过对28 位充血性心肌病患者心肌组织活检的分析证实:心肌细胞上有C5b29 复合物的沉积,并且与免疫球蛋白的沉积、心肌细胞TNF2α的表达,有明显的相关性[13～15]。

　　Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其水平的提高势必有利于这些酶活性的提高。Zn 对细胞保护作用的途径之一,是基于控制过氧化作用,其作用机理,可能是竞争性结合膜蛋白上的巯基,有效地抵制它氧化成二硫键,阻止脂质过氧化反应,从而保护细胞膜的稳定性。VE 作为第一线的抗氧化保护剂阻止脂质过氧化,在自由基进攻的早期,通过在生物膜中的自由基瘁灭作用,保护细胞膜中的多不饱和脂肪酸[16～18]。含硒的谷胱甘肽过氧化物酶可在脂质过氧化物破坏细胞膜前就把它们清除掉。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用。VE 的分子结构上其酚羧基的氢原子可提供给自由基,使之还原成脂质氢过氧化物阻断生物膜上多不饱和脂肪酸的自身过氧化。并且VE 还可结合生物膜上,保护生物膜免受自由基的攻击和氧化损伤。同时VE 能增强GSH2Px 的活性,并与GSH2Px 协同地终止脂质过氧化及与磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶一起抑制微粒体膜磷脂过氧化[19，20]。

　　本实验通过免疫组织化学方法观察到: 正常对照组Livin表达呈阴性, 糖尿病对照组Livin表达呈阳性;糖尿病补锌组Livin表达呈弱阳性，糖尿病补VE组结果与糖尿病补锌组相同;糖尿病补Zn+VE组Livin表达呈阴性。图像分析结果显示:糖尿病补Zn+VE组与糖尿病对照组、糖尿病补锌组及糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05);糖尿病对照组与糖尿病补锌组、糖尿病补VE组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0.05)。Zn 作为机体必需的微量营养元素,是体内200多种蛋白酶的金属配基,其水平的提高势必有利于这些酶活性的提高。Zn 对细胞保护作用的途径之一,是基于控制过氧化作用,其作用机理,可能是竞争性结合膜蛋白上的巯基,有效地抵制它氧化成二硫键,阻止脂质过氧化反应,从而保护细胞膜的稳定性。VE 作为第一线的抗氧化保护剂阻止脂质过氧化,在自由基进攻的早期,通过在生物膜中的自由基瘁灭作用,保护细胞膜中的多不饱和脂肪酸[21～23]。VE 作为天然抗氧化成分,对维持体内自由基平衡,促进机体正常发育,保护细胞膜稳定具有重要作用。表明Zn+VE联合作用后可减少由于高血糖引起的心肌细胞的凋亡,对心肌细胞起了重要的保护作用。其确切机制还有待于进一步研究探讨。

【参考文献】
  　1 Tilg H,Moschen AR.Inflammatory mechanisms in the regulation of insulin resistance,Mol Med,2008,14(34):222～231.

　　2 Münzberg H,Myers MG.Molecular and anatomical determinants of central leptin resistance,Nat Neurosci,2005,8(5):566～570.

　　3 Rebecka S H , Philip H K, Thomas J, et al . Association between Diabetes Mellitus, Hypothyroidism or Hyperadrenocorticism and At herosclerosis in Dogs.J Vet Intern Med ,2003,17:489～494.

　　4 Kominskydj,Bickel RJ, Tyler KL. Reovirus2induced apop tosis requires mitochondrial release of smac /D IABLO and involves reduction of cellular inhibitor of apoptosis p rotein levels. Virol, 2002,76 (22) : 1414～1424.

　　5 Du Chunying, Fang Min, Li Yucheng,, et al. Smac a mitochondrial protein that promotes cytochrome Cindependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell, 2000, 102: 33～42.

　　6 Vvrhagen AM, Ekert PG, Pakusch M, et al. Identification of DIABLO, amammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antaonizing IAP protein. Cell, 2000, 102: 43～53.

　　7 Ryter S. W, Kim, H. P, Hoetzel A, et al. Mechanisms of cell death in oxidative stress. Antioxid Redox Signal,2007, 9: 49～89.

　　8 Giancarlo V, NigelMW.Microalbuminuria reduction with valsartan in patients with type2 diabetesmellitus: a blood pressure-independent effect. Circulation, 2002,106(3):672～678.

　　9 Lewis EJ,Hunsicker LG, Clarke WR, et al.Renoprotective effect of the angiotensinreceptor antagonis tirbesartan in patients with nephropathy due to type 2 diabetes.N Engl JMed,2001,345(12):851～860.

　　10 BrennerBM, CooperME, Zeeuw D, et al.Effects of losartan on renal and cardiovascular outcomes in patientswith type 2 diabetes and nephropathy.New Engl JMed, 2001,345(12):861～869.

　　11 Chai J,Du C,Wu JW, et al. Structure and BiochemicalBasis of Apoptotic Activation by Smac/D IABLO.Nature,2000,406(6798):855～862.

　　12 Wu G,Chai J, Suber TL, et al. Structural basis of IAP recognition by Smac/DIABLO. Nature,2000,408(6815):1008～1012.

　　13 McNeish IA ,Bell S ,McKay T,et al.Expression of Smac/ DIABLO in ovarian carcinoma cells induces apoptosis via a caspase-9-mediated pathway. Exp Cell Res,2003,286(2):186～198.

　　14 Olivier E ,Pardo,Adeline Lesay,et al.Fibroblast growth factor-mediated translational control of IAPs blocks mitochondrial release of Smac/DIABLO and apoptosis in small cell lung cancer cells. Molecular and Cellular Biology ,2003 ,23 (21):7600～7610.

　　15 Deng Yibin , Lin Yahong , Wu Xiangwei. TRAILinduced apoptosis requires Baxdependent mitochondrial release of Smac/ DIABLO.Genes&Dev ,2002 ,16:33～45.

　　16 Sharifi A. M, Mousavi S. H, Bakhshayesh M, et al.Study of correlation between leadinduced cytotoxicity and nitric oxide production in PC12 cells. Toxicol Lett,2005, 60:43～48.

　　17 Ji, L. L. Exercise and oxidative stress: role of the cellular antioxidant systems. Exerc Sport Sci Rev,1995, 23:135～166.

　　18 Chance B, Sies H, Boveris A. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol Rev,1979, 59:52～605.

　　19 Kleszczewska, E.Biological role of reactions of Lascorbic acid with metals. Postepy Hig Med Dosw,2001,55:81～94.

　　20 Upasani C. D, Khera A, Balaraman R. Effect of lead with vitamin E, C, or Spirulina on malondialdehyde, conjugated dienes and hydroperoxides in rats. Indian J Exp Biol,2001, 39:70～74.

		自动登录	找回密码
密码			立即注册

[临床医学] 锌和维生素E对Ⅰ型糖尿病大鼠心肌凋亡促进因子Smac表达的作用