STAT3基因在骨肉瘤组织中的表达及临床意义

jz066520 · 发表于 2014-6-2 10:27:57

【摘要】  目的：探讨信号转导与转录激活因子3( signal transducerand activator of transcription 3,STAT3)基因在骨肉瘤组织中的表达及临床意义。方法：将武汉市四大三级甲医院收集的骨肉瘤20例及良性骨软骨瘤5例标本,应用免疫组织化学方法检测各组组织中STAT3基因的表达水平, 采用HPIAS1000图文报告管理系统对STAT3基因的表达进行定量分析，并用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果：STAT3基因在骨肉瘤组织中呈高表达, STAT3基因在良性骨软骨瘤组织中呈低表达, STAT3基因在骨肉瘤组织中的表达与良性骨软骨瘤组织的表达比较差异有显著性(P<0.05)。结论：STAT3基因在骨肉瘤的分子发病机制中可能起了重要的作用,并可作为判断骨肉瘤患者预后的参考指标之一。

【关键词】  骨肉瘤; STAT3癌基因; 免疫组织化学

骨肉瘤是最常见的骨原发恶性肿瘤。美国每年约诊断900例骨肉瘤，中国骨肉瘤发病率在原发恶性肿瘤中居首位，发病率为1.5～2.0/10万，多发于10～20岁的青少年的长骨,尤以股骨下段和胫骨上段多见[1]。骨肉瘤早期临床症状无特异性,且病情进展较快,大多数病例就诊时已经进入临床ⅡB期。这些患者中有相当一部分会出现肺转移,肺转移是其主要死亡原因,80%的病例在确诊时已有肺部微小转移灶[2～4]。

　　信号转导和转录活化因子(signal transducers and activators of transcription, STATs)家族是一种存在于胞浆并在激活后能够转入核内与DNA结合的蛋白家族,具有信号转导和转录调控双重功能[5]。STATs蛋白广泛表达于机体不同类型的细胞和组织中,参与细胞生长、分化、凋亡等多种生理功能的调控,并与炎症、肿瘤和免疫反应关系密切。STATs家族成员中,STAT3与肿瘤的关系最为密切[6～7]。

　　本研究通过应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测骨肉瘤及良性骨软骨瘤组织中STAT3的表达水平，探讨STAT3在骨肉瘤发生、发展过程中的作用机制，为临床上防治骨肉瘤提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 材料来源及分组收集武汉市四大三级甲医院病理科2000～2008年骨肉瘤存档蜡块20例及良性骨软骨瘤存档蜡块5例。所有切片经病理学专家诊断为骨肉瘤及良性骨软骨瘤。

　　1.1.2 材料采用免疫组织化学SP法检测STAT3基因在骨肉瘤与良性骨软骨瘤组织中的表达。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　1.2.1 主要试剂 STAT3兔抗人多克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.2.2 主要仪器 YWY781型医用微波仪，250 W，50 Hz (浙江临安电子器材厂生产);家用高压锅;电热恒温干燥箱 (湖北黄石医疗器械厂生产);显微镜成像系统 (Olympus公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 蜡块切片厚5μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。

　　1.3.2 免疫组织化学SP法检测STAT3相关抗原

　　具体步骤：

　　① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;

　　③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　④ 正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;

　　⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;

　　⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应;

　　⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;

　　⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;

　　用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为阳性对照组。

　　1.3.3 免疫组织化学结果判断

　　STAT3阳性染色为棕黄色颗粒，定位于细胞核和胞质内。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

　　采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对STAT3基因的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ,测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

　　1.4 统计学处理

　　数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5 软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。

　　2 结果

　　在骨肉瘤组中可见密集分布的棕黄色颗粒，STAT3基因呈阳性表达;在良性骨软骨瘤组中可见少量的棕黄色颗粒，STAT3基因表达呈弱阳性或阴性。图像分析结果显示: 骨肉瘤组STAT3基因表达的平均光密度为0.2840±0.0107, 良性骨软骨瘤组STAT3基因表达的平均光密度为0.0954±0.0054; 骨肉瘤组STAT3基因表达的阳性面积率为0.3254±0.0497, 良性骨软骨瘤组STAT3基因表达的阳性面积率为0.1536±0.0127,经单因素分析骨肉瘤组与良性骨软骨瘤组比较(P<0.05)，差异有显著性。见表1。表1 骨肉瘤组与良性骨软骨瘤组STAT3基因表达的平均光密度和阳性面积率注：* 骨肉瘤组与良性骨软骨瘤组比较，P<0.05。　　3 讨论

　　骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤, 病情凶险,预后较差,多数病例在原发灶较小的早期即发生广泛的肺转移,以能产生骨样组织的梭形基质细胞为特征,是骨骼系统最常见的恶性肿瘤,多发于青少年,好发于血运丰富的干骺端,其血行转移发生率高且早,进展迅速。其病因和发病机理尚未清楚。越来越多的研究结果表明,骨肉瘤的发生、发展、预后与癌基因和抑癌基因的异常表达密切相关[8～10]。因此, 近些年有许多学者着重研究骨肉瘤的分子发病学, 为观察骨肉瘤预后和转移寻找新的指标, 也为寻找骨肉瘤新的治疗方法提供了理论基础。

　　信号转导和转录活化因子(STAT3)是STATs家族的重要成员，已被认为是一种癌基因,与肿瘤的发生、发展有密切关系，其过度激活将导致细胞的异常增殖和凋亡障碍，促进肿瘤细胞的形成[11～13]。STATs家族是一种存在于细胞浆并在激活后能够转入核内与DNA结合的独特的蛋白家族，它与酪氨酸磷酸化信号通道偶联，发挥信号转导和转录调控的作用[14]。JAK/sTAT代表的是一条极其快速的从细胞外到细胞核的信号转导通路。近年来发现JAK/sTAT途径的激活,特别是STAT3的激活,对于细胞的生长、增殖和转化产生重要影响。已有研究证实STAT3的酪氨酸磷酸化,即信号依赖的活化形式,在多种肿瘤中普遍存在,并在某些肿瘤中发挥重要作用[15]。信号转导子和转录激活子3( signal transducerand activator of transcription 3,STAT3)是一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通道偶联的双功能蛋白。STAT3过度激活将导致细胞的异常增殖和凋亡障碍,促进肿瘤的形成、发展。其致癌机制为促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促血管生成而加快转移[16～19]。

　　本实验结果显示, STAT3在骨肉瘤的表达明显高于对照组(P<0.05)，骨肉瘤组与对照组比较(P<0.05)，差异有显著性。结果证实STAT3在肿瘤发生、生长、转移等过程中有促进作用，提示STAT3高表达可能参与、促进了骨肉瘤的发生和发展。STAT3因子的过度表达可能促使骨肉瘤细胞的增殖、分化，并抑制其凋亡，其过度激活可以促进肿瘤细胞的形成及发展，从而促进肿瘤的发生和发展。其确切机制有待进一步研究。

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