MLH1基因在喉鳞癌中的表达及意义

jz066520 · 发表于 2014-6-2 10:28:22

【摘要】  目的：探讨人喉鳞癌中MLH1基因的表达及意义。方法：采用免疫组化法分别检测20例喉癌组织及癌旁组织MLH1基因的表达。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对MLH1基因的表达进行定量分析。结果：喉癌癌细胞核和细胞质中可见少量的棕黄色颗粒, MLH1基因表达弱;对照组中,细胞核及细胞质中可见一些棕黄色颗粒, MLH1基因表达强。图像分析结果显示: 喉癌组MLH1基因表达的平均光密度为0.0694±0.0018, 对照组MLH1基因表达的平均光密度为0.2518±0.0257;喉癌组MLH1基因表达的阳性面积率为0.0738±0.0021, 对照组MLH1基因表达的阳性面积率为0.3257±0.0350，经单因素分析喉癌组与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。结论：MLH1基因在喉癌组织中表达降低,可能在喉癌的发生机制中起了一定的作用。

【关键词】  喉鳞癌; 人类错配修复基因; 免疫组织化学

MLH1是人类错配修复基因( human mismatch repair gene, hMMR)家族中一个重要的基因，MMR对保持遗传信息的完整性和稳定性，避免遗传突变的产生具有重要作用，MLH1的功能缺陷被认为是肿瘤发病的重要机制, 成为近年来研究的热点。研究表明，MMR与结直肠癌、食管癌、胃癌、宫颈癌等关系密切[1，2]，但在喉癌中的表达状况报道甚少。本实验通过免疫组化方法检测喉癌和癌旁组织中MLH1基因的表达状况，探讨它与喉癌临床病理特征的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 材料来源收集武汉市中心医院病理科2007～2009年喉癌存档蜡块20例，其中男性18例，女性2例。所有切片经病理学专家诊断为喉鳞状细胞癌，所有病例均为首次发病，并且均是术前未接受过放疗、化疗的病人。另取瘤组织周围组织5例(癌旁组织选自手术切除标本远离肿瘤端,切缘经病理证实未见癌细胞)作对照。

　　1.1.2 材料分组将实验分为喉癌组和对照组。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　1.2.1 主要试剂浓缩型鼠抗人MLH1基因单克隆抗体,(北京中山生物技术有限公司);超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.2.2 主要仪器 YWY781型医用微波仪，250 W，50 Hz (浙江临安电子器材厂生产);家用高压锅;电热恒温干燥箱 (湖北黄石医疗器械厂生产);显微镜成像系统 (Olympus公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 蜡块切片厚5μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。

　　1.3.2 免疫组织化学SP法检测MLH1相关抗原

　　具体步骤：

　　① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;

　　③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　④ 正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;

　　⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;

　　⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;

　　⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5min)，自来水冲洗终止反应;

　　⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;

　　⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;

　　用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为阳性对照组。

　　1.3.3 免疫组织化学结果判断

　　MLH1基因以胞核或胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

　　采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对MLH1基因的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ,测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

　　1.4 统计学处理

　　数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。

　　2 结果

　　喉癌癌细胞核和细胞质中可见少量的棕黄色颗粒, MLH1基因表达弱;对照组中,细胞核及细胞质中可见一些棕黄色颗粒, MLH1基因表达强。图像分析结果显示: 喉癌组MLH1基因表达的平均光密度为0.0694±0.0018, 对照组MLH1基因表达的平均光密度为0.2518±0.0257;喉癌组MLH1基因表达的阳性面积率为0.0738±0.0021, 对照组MLH1基因表达的阳性面积率为0.3257±0.0350，经单因素分析喉癌组与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。见表1。表1 喉癌组与对照组中MLH1基因表达的平均光密度

　　3 讨论

　　恶性肿瘤的发生发展是多步骤多因素参与的复杂过程,其发病机制在分子水平上涉及到癌基因、抑癌基因、凋亡调节基因和错配修复基因等。人类DNA错配修复基因(MMR)包括9个，即hMLH1、hMLH3、hPMS1、hPMS2、hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、 hMSH6。hMLH1位于染色体3p21-23，基因组全长约58kb，含19个外显子，cDNA 有2 268bp的开放阅读框架，编码蛋白质756个氨基酸，其编码的蛋白质产物参与hPMS2结合形成异源二聚体，识别错配位点，参与错配修复，主要作用是保持遗传物质的完整性和稳定性,保证DNA复制的忠实性[3～5]。近年来研究发现错配修复基因的改变可引起微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI),使癌基因、抑癌基因的突变积累,导致癌基因激活和抑癌基因失活,最终引起细胞恶变,肿瘤形成。其中hMLH1和hMSH2研究较为透彻,其功能缺陷或表达降低,与胃肠道、呼吸和泌尿系统等肿瘤的发病关系密切。MSI的发生与MMR的表达存在相关性，微卫星不稳定和错配修复基因异常可能参与部分喉鳞状细胞癌的发生[6]。但是也有相反结论，Smigiell[7]认为喉癌MLH1基因失活并不会导致MSI。错配修复(MMR) 是DNA 修复的主要途径之一,它针对DNA 发生错配的碱基进行修复,是通过细胞内的错配修复系统来完成的。该系统由错配修复基因编码的一系列酶组成,存在于原核生物和真核生物中,能够特异性识别、切除并修复错配碱基,以保证DNA 复制的忠实性,保持遗传物质的稳定性和完整性,从而避免基因突变的发生[8]。在错配修复过程中,hMSH2 其蛋白表达产物分别与hMSH6 和hMSH3蛋白构成异源二聚体hMutSα和hMutSβ,识别碱基错本配并与之结合,启动修复过程,而且hMSH2基因的作用处于主导地位[9，10]。hMLH1 蛋白在执行错配修复时分别与hPMS2和hMLH3 蛋白构成异源二聚体hMutLα和hMutLβ,但它们在错配修复过程中的具体机制尚不明确[11，12]。错配修复的基本功能就是去除复制过程中的碱基错配及聚合酶滑链造成的插入缺失环,校正非同源染色体重组而保持整个基因组的稳定。错配修复系统发挥作用时,整个修复过程包括三个步骤:错配识别、含错配碱基的区段的剪切、剪切后再合成[13～15]。实验采用免疫组化法分别检测了喉癌组织及癌旁组织MLH1基因的表达。结果提示，喉癌组织中MLH1基因表达弱;对照组中, MLH1基因表达强。经单因素分析喉癌组与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。提示MLH1基因的表达下调是喉鳞癌发病的危险因子,可能与喉鳞癌的发生发展密切有关。

　　虽然错配修复基因被发现以来，已对其研究已经取得很大进展，但是错配修复基因受哪些因素影响，它能否作为恶性肿瘤的特征性指标，仍需要人们进一步研究，另外检测错配修复基因突变尚需寻找更有效和简便的方法,才具有应用价值。这些都有待于我们今后的进一步研究和探讨。

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　　收稿日期：20091225 通讯作者：张端莲

　　# 现工作单位：十堰市太和医院骨外科;武汉大学在读硕士。

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