注射用银杏达莫（冻干）安全性实验研究

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     作者：沈祥春，江帆，任飞，史琴，彭佼

【摘要】  目的对注射用银杏达莫（冻干）进行肌肉刺激性、血管刺激性、豚鼠主动全身过敏反应、大鼠被动皮肤过敏反应及溶血实验，为其临床应用提供安全性实验依据。方法肌肉刺激性实验，观察2只家兔注射用银杏达莫（冻干）后48 h的变化。血管刺激性实验，观察连续用药5 d注射用银杏达莫（冻干）及生理盐水，以及恢复14 d后的注射局部血管和周围组织反应情况。豚鼠主动全身过敏反应，在第1次给药后14 d及21 d，分别从足背静脉注射注射用银杏达莫（冻干）观察注射后15 min动物的过敏症状。大鼠被动皮肤过敏实验，采用0.5%伊文思兰溶液分析法。体外溶血实验，观察该品在3 h内有无溶血和聚集现象。结果注射用银杏达莫（冻干）对家兔股四头肌、耳缘静脉未见明显刺激作用，对豚鼠主动全身过敏反应及大鼠被动皮肤过敏反应均未见明显过敏反应；未见明显体外溶血作用。结论注射用银杏达莫（冻干）的安全性实验结果提示其安全可靠。

【关键词】  注射用银杏达莫（冻干）； 安全性

　　Abstract：ObjectiveTo evaluate the safety of Yinxingdamo (Freeze-dried Power). Injected by testing the muscle stimulation, vessel stimulation, active systematic anaphylaxis, passive cutaneous anaphylaxis and haemolytic test.MethodsIn the muscle stimulation test, two rabbits were observed at 48 h after injection Yinxingdamo (Freeze-dried Power); In the vessel stimulation, four rabbits were observed on the 5 d after injection Yinxingdamo (Freeze-dried Power), and the reaction after stopped treatment 14 d. Active systematic anaphylaxis was investigated by male guinea pigs, reaction was observed the 14d and 21d after the first treatment. The rat passive cutaneous anaphylaxis reaction was assayed by Evans blue. In the haemolytic test, hemolysis and coagulation were mainly observed. ResultsYinxingdamo (Freeze-dried power) injection had no stimulation to muscle and ear vein of rabbit, the guinea pigs and rats had no allergic reaction as contrast and without hemolytic reaction.ConclusionYinxingdamo (Freeze-dried Power) injection is safe and reliable based on the animal experiment.

　　Key words：Injected Yinxingdamo (Freeze-dried Power);  Safety evaluation

    银杏达莫注射液是贵州益佰制药有限公司的拳头产品，由银杏叶提取物与适量双密达莫精制而成,为中西药复方制剂。银杏叶有效成分为:银杏黄酮苷、银杏苦内酯、白果内酯等,具有清除自由基,抑制细胞膜脂质过氧化反应,竞争性拮抗血小板活化因子,抑制蛋白激酶C ,降低细胞凋亡速度,修复损伤组织等作用［1，2］。加入小剂量双密达莫后可进一步加强降低血液黏度,抑制血小板的活化和聚集,增强红细胞变形能力及携氧能力,临床上用于动脉硬化、心脑血管疾病的防治。

    由于中药的液体制剂，无论是针剂还是口服制剂，都有可能在长时间放置后出现沉淀，从而导致不良反应的产生，一般是因为氧化和溶剂的极性发生了改变造成的。冻干粉针剂的冷冻干燥在低温下进行，物质中的一些有效成分损失很小，而微生物的生长和酶的作用无法进行，能保持原来的形状；干燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状。由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护；干燥能排除95%～99%以上的水分，使干燥后产品能长期保存而不致变质。

    基于冻干粉针剂的优点与中药注射液的缺陷，益佰药物研究所为提高品种的质量和临床用药的安全性，研制注射用银杏达莫（冻干）。本次实验评价益佰药物研究所研制的注射用银杏达莫（冻干）是否符合静脉注射药物的安全性标准,为其进入临床应用提供实验依据。

　　1  材料

　　1.1  药物与试剂注射用银杏达莫（冻干），黄色冻干粉针剂，人用量(2～5支溶于500 ml生理盐水2次/d)贵州益佰医药有限公司，批号040805。卵蛋白，上海伯奥生物科技有限公司。百日咳菌苗，卫生部上海生物制品厂研究所。伊文思兰，中国医药(集团)上海化学试剂公司。

　　1.2  动物日本大耳白兔、SD大鼠、豚鼠等均由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2002-2001。

　　2  方法

　　2.1  药物的配制

　　2.1.1  体外溶血、肌肉与血管刺激性实验药物配制1支粉针剂溶于100 ml 0.9%的生理盐水中。

　　2.1.2  豚鼠主动全身过敏反应

    高剂量组：1支粉针剂溶于6 ml 0.9%的生理盐水中，给药容积为10 ml/kg。

    低剂量组：1支粉针剂溶于12 ml 0.9%的生理盐水中，给药容积为10ml/kg。

    卵蛋白：临用前用氯化钠注射液配成0.5%浓度用于豚鼠腹腔注射，给药容积为2 ml/kg。

    激发给药药物配制：高剂量组：2支粉针剂溶于3 ml 0.9%的生理盐水中，给药容积为5 ml/kg；低剂量组：2支粉针剂溶于6 ml 0.9%的生理盐水中，给药容积为5 ml/kg。

　　2.1.3  大鼠被动皮肤过敏反应高剂量组：1支粉针剂溶于3 ml 0.9%的生理盐水中，给药容积为10 ml/kg。

    低剂量组：1支粉针剂溶于6 ml 0.9%的生理盐水中，给药容积为10 ml/kg。

　　2.2  肌肉刺激性实验［3］取健康家兔2只，于本实验环境下饲养1周，以熟悉实验室条件。每只分别于一侧股四头肌处以无菌操作方法注射，注射用银杏达莫（冻干）溶液1 ml；另侧相应部位同法注射等容积灭菌生理盐水作为对照。正常供应饲料和水。48 h后放血处死家兔，解剖股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉的刺激反应，按表1换算成相应的反应级分值。表1  肌肉刺激反应分级标准（略）

　　2.3  血管刺激性实验［4］取健康成年家兔4只，耳缘静脉注射药物3 ml/只(右耳)，在对侧耳注射生理盐水3 ml/只做阴性对照(左耳)。连续用药5 d。观察给药后不同时间注射局部血管和周围组织反应情况，如充血，水肿等。用药周期根据药物拟用于临床的情况定。在第5天用药后48～96 h对动物和注射部位进行肉眼多次观察和检查，处死2只动物，取注射部位血管和周围组织进行组织病理学检查。14 d后，处死另外2只动物，送病理检查。

　　2.4  豚鼠全身主动过敏反应实验［3,5］选择体重300～400 g的健康雄性豚鼠24只，按体重将豚鼠随机分成4组（每组6只），即生理盐水组、注射用银杏达莫（冻干）高剂量组（临床给药剂量的10倍）与低剂量组（临床给药剂量5倍）和卵蛋白组。按注射剂过敏试验要求，分别给豚鼠隔日腹腔注射配置的注射用银杏达莫（冻干）、生理盐水(10 ml/kg)和 0.5%卵蛋白0.5 ml，共3次。将每组内分成两批，分别在第1次给药后14 d及21 d从足背静脉注射注射用银杏达莫（冻干）和生理盐水(5 ml/kg)和0.5%卵蛋白2 ml，注射后立即观察有无过敏症状，如兴奋不安、抓鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、休克甚至死亡等症状，持续观察3 h。按表2分级，判定其反应级数。表2  豚鼠过敏反应级数（略）

　　2.5  被动皮肤过敏反应实验［3，6］

　　2.5.1  大鼠含IgE的抗血清制备取4只健康雄性SD大鼠，按注射剂大鼠同种被动皮肤过敏实验的要求，分别腹腔注射注射用银杏达莫（冻干）药物10 ml/kg(高、低两剂量组)，0.25%的卵蛋白生理盐水溶液10 ml/kg，生理盐水10 ml/kg，同时腹腔注射百日咳疫苗2×1010/只。13 d后眼眶取血，分离得血清，-20℃备用。

　　2.5.2  大鼠同种被动皮肤过敏反应实验取40只健康SD大鼠，雌雄各半。于本实验环境下饲养1周，并观察自主活动及一般状况。随机分成阳性药物组(卵蛋白组)﹑空白对照组和注射用银杏达莫（冻干）高低两剂量组。在背中线两侧距脊柱约1.5cm处用8%的硫化钠溶液脱毛，每侧2点，间隔2cm。取上述含IgE的血清，用生理盐水分别稀释为1∶5，1∶10，1∶20，1∶40倍，按不同浓度次序，分别皮内注射于各组大鼠去毛各点。48 h后，注射用银杏达莫（冻干）组分别静脉注射含0.5%伊文思兰的注射用银杏达莫（冻干）溶液1 ml攻击，阳性药组静脉注射含0.5%伊文思兰的0.5%的卵蛋白生理盐水1 ml攻击，空白对照组静脉注射0.5%伊文思兰的生理盐水溶液1 ml攻击。30 min后处死动物，检查注射各点的蓝色反应斑。　　2.6  体外溶血实验［7］取健康家兔1只，自心脏取血约20 ml，置于预先放有玻璃珠的三角瓶中，搅拌去纤维蛋白，然后将血移入刻度离心管内，加入生理盐水5～10 ml，混匀后离心5 min(2 000～2 500 r/min)，去除上清液，再加生理盐水混匀离心，反复洗3～4次，至上清液无色透明，将所得红细胞按其容积用生理盐水稀释成2%的混悬液。取试管7支，编号排列于试管架上，按表3加入各种溶液，第6管不加注射用银杏达莫（冻干）药液作为空白对照管；第7管不加药液，用蒸馏水代替生理盐水，作为溶血的阳性对照组，将各管轻轻摇匀，在37℃水浴中保温3 h，开始每隔15 min观察1次。1 h后，每隔1 h观察1次，记录3 h。表3  体外溶血实验配比量（略）

    全溶血：溶液澄明红色，管底无细胞残留。部分溶血：溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留。无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明。凝集：虽不溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不能分散。

　　3  结果

　　3.1  肌肉刺激性实验注射后不同时间观察结果表明股四头肌表面未见明显充血，红肿，家兔活动正常，未见明显异常反应。两只家兔48 h后健康如常，解剖观察股四头肌，给药部位均有轻度红肿、充血等现象，评分1级。按照国家药品食品监督管理局新药（中药）研究办法的要求，以上试验结果提示，注射用银杏达莫（冻干）未见明显肌肉刺激性。

　　3.2  血管刺激性实验每天注射后观察，双侧耳未见明显充血水肿，注射后1 h内，动物未见明显异常反应。病理组织学检查结果提示：给药结束左耳鳞状上皮无增生、萎缩，上皮下无充血、水肿及炎症；除1只动物右耳有轻微炎症反应发生，其余未见明显炎症反应。恢复14 d后各动物左右耳均未见血管扩张和炎细胞浸润。本品对家兔血管未见刺激性。

　　3.3  豚鼠全身主动过敏反应实验注射用银杏达莫（冻干）组与生理盐水组两批豚鼠分别于第1次给药后14 d及21 d，由足背静脉注射注射用银杏达莫（冻干）或生理盐水5 ml/kg，注射后豚鼠均未出现兴奋不安、呼吸困难、抓鼻、颤抖、竖毛、痉挛、抽搐、大小便失禁、休克死亡等过敏反应，判定为0级，提示注射用银杏达莫（冻干）未见全身主动过敏反应；而阳性组卵蛋白组两批豚鼠分别于第1次给药后14 d及21 d，足背静脉注射0.5％卵蛋白 2 ml，注射后两批豚鼠在5 min内均出现兴奋不安、呼吸困难、抓鼻、颤抖、竖毛、痉挛、抽搐、大小便失禁、休克死亡等过敏反应，判定为4级。

　　3.4  大鼠同种被动皮肤过敏反应实验注射用银杏达莫（冻干）组﹑生理盐水组大鼠背部皮肤均未见明显蓝色反应斑点。而卵蛋白组8只大鼠背部1∶5，1∶10注射点均出现明显蓝色反应斑。结果表明，注射用银杏达莫（冻干）未见明显同种被动皮肤致敏作用。

　　3.5  体外溶血实验第7管（阳性对照管）溶液呈现澄明红色，其余6管均末见澄明红色，红细胞全部下沉，上层液体无色澄明。表明注射用银杏达莫（冻干）未见明显体外溶血作用。结果见表4。提示注射用银杏达莫（冻干）无溶血和凝集反应。表4  不同时间点溶血实验结果（略）

　　4  讨论

    药物刺激性、过敏性、溶血性是指药物制剂经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、皮下、静脉旁和鞘内等非口服途径给药,对用药局部产生的毒性(如刺激性和过敏性等)和/或对全身产生的毒性(如过敏性、溶血性等),它是临床前安全性评价的重要组成部分。药物的活性成分及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质(如pH 值、渗透压等) 均有可能引起刺激性和/或过敏性和/或溶血性和/或热原反应的发生,而严重的毒性可以影响用药的安全有效性,因此药物在临床应用前应该研究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性,以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围、临床研究监测指标并为临床解毒或解救措施提供参考,保障临床用药的安全有效。综合考虑以上各实验的结果，以便为药物的临床研究与应用提供一定的药物毒理学基础。

    本次实验的受试药物注射用银杏达莫（冻干）对红细胞未见明显溶血和凝集作用；家兔静脉注射、肌肉注射给药后未见明显血管、肌肉刺激性；豚鼠静脉注射后第0，14，21 d未见明显全身主动过敏反应；也未见明显大鼠同种被动皮肤过敏；以上结果提示注射用银杏达莫（冻干）安全性较好，为其临床应用提供实验依据。



【参考文献】
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