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【摘要】 目的建立提取和测定北五味子中多糖含量的方法。方法采用比色法测定北五味子中多糖含量。结果测得北五味子中多糖含量为6.57%，平均回收率为99.78%，RSD=1.54%。结论 该方法简便、精密度及重现性均较好，结果令人满意。
【关键词】 北五味子 多糖 提取 含量测定
Extraction and Determination of Polysaccharide from Schisandra chinensis (Turcz) Baill Fruit
Abstract：ObjectiveTo establish a method for the extraction and detemination of polysaccharide from Schisandra chinensis (Turcz) Baill Fruit.MethodsPolysaccharide in Schisandra chinensis (Turcz) Baill Fruit was determined by the method of Spectrophoto metry.ResultsThe polysacharides in Schisandra chinenisis (Turcz) Baill Fruit was 6.57%,the average recovery was 99.78%,RSD was 1.54%.ConclusionThis method is simple，the result is stable，reproducible, and satisfactory.
Key words：Schisandra chinensis (Turcz) Baill； Polysaccharide; Extraction; Determination
北五味子Schisandra chinensis(Turcz）Baill Fruit是木兰科植物五味子的干燥成熟果实，是著名的滋补性中药，因其果实甘、酸、辛、苦、咸五味俱全，故名五味子，具有敛肺、滋肾、生津、收汗、涩精之功效。现代药理研究证实五味子对中枢神经系统、呼吸系统均有兴奋作用，亦能促进肝糖原异生，加快肝糖原分解，在治疗神经衰弱、肝炎等的药物中应用十分广泛。五味子有南北之分，据《本草纲目》记载“五味子南产者红，北产者黑，入滋补药，必用北者为良”，北五味子的化学成分主要为五味子木脂素、挥发油、五味子醇、多糖等［1］。近年来对多糖提取工艺的研究方法很多，如热水浸提法、稀碱液浸提法、稀酸液浸提法。但多糖是由单糖基通过糖苷键连接而成的化合物，在稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，因此本文采用热水浸提法，用苯酚-硫酸法测定北五味子多糖的含量，得到满意的结果。
1 仪器与药品
北五味子购于张家口市药材公司经鉴定为北五味子，其它试剂均为国产分析纯；UV752分光光度计（上海第三仪器厂）；GOA型电热真空干燥箱（天津东郊机械加工厂）；RE52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。
2 方法与结果
2.1 葡萄糖储备液的配制精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg，用蒸馏水溶解并定容到100 ml。
2.2 苯酚溶液的配制取苯酚100 g，加铝片0.1 g和NaHCO3 0.05 g，蒸馏，收集182℃馏份，称取7.5 g，加水150 ml溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。
2.3 测定条件选择
2.3.1 反应温度选择精密吸取葡萄糖储备液1.0 ml于100 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，作为对照品溶液。分别吸取葡萄糖对照品液1.0 ml于两个具塞试管中，各加苯酚液1.0 ml，并分别迅速滴加浓硫酸5.0 ml。另取两份1.0 ml水同上操作，为空白液。一份于水浴中煮沸15 min，另一份于40℃水浴中恒温30 min取出，冷却至室温，15 min后于490 nm处测其吸光度值，分别为0.112和0.126。因此，本实验采用40℃恒温30 min的方法。
2.3.2 苯酚及硫酸用量选择吸取葡萄糖对照品液1.0 ml5份，分别加入苯酚液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，分别加水至2.0 ml，再各滴加浓硫酸5.0 ml，40℃恒温30 min后，测其吸光度值，分别为0.095，0.112，0.125，0.127，0.126，可见加入苯酚液0.6 ml以上时，反应都能完成；另取葡萄糖对照品液1.0 ml5份，分别加苯酚液1.0 ml，再分别滴加浓硫酸2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml，并均用水稀释至8.0 ml，加入硫酸体积占总体积的62.5%以上时的结果较满意。
2.3.3 反应时间选择及稳定性取葡萄糖对照品溶液1.0 ml3份，各加苯酚液1.0 ml，浓硫酸5.0 ml，于40℃分别恒温20，30，40 min。测得吸光度值分别为0.16，0.125，0.126，可见加热30 min即可使反应完全。另测反应完成后样品在不同时间内的吸光度值，结果3 h内稳定。 2.4 标准曲线绘制精密量取葡萄糖标准溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml置具塞试管中，分别加蒸馏水使成1.0 ml，再分别加入苯酚溶液1.0 ml，摇匀，然后加浓硫酸5.0 ml，充分摇匀，于40℃水浴中恒温30 min，取出，冷却至室温，另以蒸馏水同上操作为空白对照，在490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，建立回归方程：A=0.067 81C+0.006 204 71，r=0.999 8。
2.5 精密度实验精密吸取对照品溶液1.0 ml，6份，同2.4项下操作，结果显示吸光度的RSD=1.45%。
2.6 多糖的提取流程北五味子粉碎后，称取500 g，用清水洗净，加水4 500 ml，微沸煎煮1 h。过滤，滤渣加水2 000 ml，煎煮1 h，过滤，合并提取液，加热浓缩至300 ml。加入乙醇使乙醇含量为80%放置12 h，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤，得到棕色粗多糖。将粗多糖溶于水，用seveg法除去蛋白，加入1%活性碳脱色，抽滤，滤液加入乙醇，使溶液含醇达80%，静置过夜，抽滤，残渣用无水乙醇、丙酮反复洗涤，真空干燥，即得精制北五味子多糖。
2.7 换算因子测定
精确称取60℃干燥恒重的五味子多糖20 mg，加水溶解后定容到100 ml容量瓶中，摇匀，作为多糖储备液精确量取多糖储备液0.2 ml，加水至1.0 ml按测量标准曲线同样的方法测其吸光度值，根据标准曲线计算浓度。按下式计算换算因子：f=W/CD式中：W为多糖重量（μg），C为测试液中据标准曲线方程计算得到的单糖浓度（μg·ml-1）D为多糖的稀释因子，测得f=1.748，（n=6）。
2.8 样品含量的测定
准确称取干燥五味子粉末100 mg，3份，分别置于索氏提取器中，用80%乙醇回流提取1 h，改用水微沸煎煮，3份分别煎煮1，2，3次，各定容至100 ml，为样品液。分别精密吸取上述样品液10 ml，分别定容至100 ml，各取1.0 ml，按2.4项下操作，平行做6次，并按下式计算多糖含量（以粗多糖计）。结果见表1。表明提取两次即可。多糖含量（%）=CDf/W×100。式中：C为样品溶液的葡萄糖的浓度（μg·ml-1），D为样品溶液的稀释因子，f为换算因子，W为样品的重量（μg）。表1 样品中多糖的含量（略）
2.9 回收率测定精密吸取样品液0.5 ml（6份）再分别精密加入不同量的标准溶液，依样品测定方法测定吸光度，计算回收率平均值为99.78%，RSD=1.54%。
3 讨论
3.1 苯酚
硫酸比色法是测定多糖含量较经典有效的方法之一，但各自的报道中，对反应温度的控制、试剂中苯酚及硫酸用量不尽相同。常见的反应温度有煮沸、40℃恒温和室温3种，鉴于冬天和夏天室温相差较大，本实验仅比较于前两种条件，证实本法以40℃恒温30 min较好。加入苯酚量0.6 ml以上时，反应能完成。对于硫酸的用量，经实验对比认为硫酸占总体积62.5%以上时，在重现性、稳定性及回收率方面都有明显的优越性，并且与文献报道一致［2］。
3.2 实验结果表明，北五味子多糖提取两次即可，平均含量为6.57%，比文献报道的稍低［3］，这可能与北五味子的产地、采收季节等因素有关。
3.3 五味子粗多糖的初步药理研究表明［4］，五味子粗多糖能明显提高小鼠的耐缺氧能力，具有抗疲劳作用，亦能使正常小鼠胸腺和脾脏的重量的增加。说明五味子粗多糖能够提高机体对环境的适应能力和防御能力。而北五味子多糖含量较高，这可能是北方五味子药效较优的原因之一，但是北五味子多糖的结构组成和生理活性有待进一步研究。
【参考文献】
［1］应国清，俞志明，单剑峰，等.北五味子有效组分的研究进展［J］.河南中医，2005，25（6）：84.
［2］Dong Q,Zheng L Y.Fang J N.Study on the determination of oligosaccharide and polysaccharide by modified phenol-sulfuric acid method［J］.中国中药杂志，1996，31（9）：550.
［3］韩学君，王发善.北五味子有效成分的高效液相层析测定［J］.黑龙江医药科学，2003，26（4）：104.
［4］苗明三.五味子多糖对衰老模型小鼠的影响［J］.中国医药学报，2002，17（3）：188. 2.4 标准曲线绘制精密量取葡萄糖标准溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml置具塞试管中，分别加蒸馏水使成1.0 ml，再分别加入苯酚溶液1.0 ml，摇匀，然后加浓硫酸5.0 ml，充分摇匀，于40℃水浴中恒温30 min，取出，冷却至室温，另以蒸馏水同上操作为空白对照，在490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，建立回归方程：A=0.067 81C+0.006 204 71，r=0.999 8。
2.5 精密度实验精密吸取对照品溶液1.0 ml，6份，同2.4项下操作，结果显示吸光度的RSD=1.45%。
2.6 多糖的提取流程北五味子粉碎后，称取500 g，用清水洗净，加水4 500 ml，微沸煎煮1 h。过滤，滤渣加水2 000 ml，煎煮1 h，过滤，合并提取液，加热浓缩至300 ml。加入乙醇使乙醇含量为80%放置12 h，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤，得到棕色粗多糖。将粗多糖溶于水，用seveg法除去蛋白，加入1%活性碳脱色，抽滤，滤液加入乙醇，使溶液含醇达80%，静置过夜，抽滤，残渣用无水乙醇、丙酮反复洗涤，真空干燥，即得精制北五味子多糖。
2.7 换算因子测定
精确称取60℃干燥恒重的五味子多糖20 mg，加水溶解后定容到100 ml容量瓶中，摇匀，作为多糖储备液精确量取多糖储备液0.2 ml，加水至1.0 ml按测量标准曲线同样的方法测其吸光度值，根据标准曲线计算浓度。按下式计算换算因子：f=W/CD式中：W为多糖重量（μg），C为测试液中据标准曲线方程计算得到的单糖浓度（μg·ml-1）D为多糖的稀释因子，测得f=1.748，（n=6）。
2.8 样品含量的测定
准确称取干燥五味子粉末100 mg，3份，分别置于索氏提取器中，用80%乙醇回流提取1 h，改用水微沸煎煮，3份分别煎煮1，2，3次，各定容至100 ml，为样品液。分别精密吸取上述样品液10 ml，分别定容至100 ml，各取1.0 ml，按2.4项下操作，平行做6次，并按下式计算多糖含量（以粗多糖计）。结果见表1。表明提取两次即可。多糖含量（%）=CDf/W×100。式中：C为样品溶液的葡萄糖的浓度（μg·ml-1），D为样品溶液的稀释因子，f为换算因子，W为样品的重量（μg）。表1 样品中多糖的含量（略）
2.9 回收率测定精密吸取样品液0.5 ml（6份）再分别精密加入不同量的标准溶液，依样品测定方法测定吸光度，计算回收率平均值为99.78%，RSD=1.54%。
3 讨论
3.1 苯酚
硫酸比色法是测定多糖含量较经典有效的方法之一，但各自的报道中，对反应温度的控制、试剂中苯酚及硫酸用量不尽相同。常见的反应温度有煮沸、40℃恒温和室温3种，鉴于冬天和夏天室温相差较大，本实验仅比较于前两种条件，证实本法以40℃恒温30 min较好。加入苯酚量0.6 ml以上时，反应能完成。对于硫酸的用量，经实验对比认为硫酸占总体积62.5%以上时，在重现性、稳定性及回收率方面都有明显的优越性，并且与文献报道一致［2］。
3.2 实验结果表明，北五味子多糖提取两次即可，平均含量为6.57%，比文献报道的稍低［3］，这可能与北五味子的产地、采收季节等因素有关。
3.3 五味子粗多糖的初步药理研究表明［4］，五味子粗多糖能明显提高小鼠的耐缺氧能力，具有抗疲劳作用，亦能使正常小鼠胸腺和脾脏的重量的增加。说明五味子粗多糖能够提高机体对环境的适应能力和防御能力。而北五味子多糖含量较高，这可能是北方五味子药效较优的原因之一，但是北五味子多糖的结构组成和生理活性有待进一步研究。
【参考文献】
［1］应国清，俞志明，单剑峰，等.北五味子有效组分的研究进展［J］.河南中医，2005，25（6）：84.
［2］Dong Q,Zheng L Y.Fang J N.Study on the determination of oligosaccharide and polysaccharide by modified phenol-sulfuric acid method［J］.中国中药杂志，1996，31（9）：550.
［3］韩学君，王发善.北五味子有效成分的高效液相层析测定［J］.黑龙江医药科学，2003，26（4）：104.
［4］苗明三.五味子多糖对衰老模型小鼠的影响［J］.中国医药学报，2002，17（3）：188. |
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发表于 2014-8-17 20:46:49
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