超声酶法提取黄柏中小檗碱的工艺研究

amy54321 · 发表于 2014-8-17 20:52:40

【摘要】  目的研究超声酶法在黄柏中小檗碱提取中的应用效果。方法采用单因素实验和正交实验考察不同因素对超声酶法提取黄柏小檗碱的影响，优选提取工艺条件。结果水浴时间2.5 h, 超声功率 80％, 加酶 25 ml, 水浴温度 60℃时提取率最高。结论超声酶法应用于黄柏小檗碱的提取，具有提取率高、省时、高效、节能等优点。

【关键词】  黄柏小檗碱纤维素酶超声波

　　Extraction Study of Berberine from Cortex Phellodendri by Ultrasonic Wave- Cellulase

　　XU Yan，LIU Shaoxia，SUN Juan

　　School of Bioscience and Technology，Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161, China

　　Abstract：ObjectiveTo study the application effect on extraction of berberine from Cortex phellodendri by ultrasonic wave- cellulase.MethodsBased on the single factors test and orthogonal test  the effect of different factors on extraction of berberine from Cortex phellodendri by ultrasonic wave-cellulase was studied,and extracting conditions was optimized.ResultsThe best extraction condition was that time was 2.5 h, the power of ultrasonic wave was 80 ℃ , the volume of cellulase was 25 ml, temperature was 60 ℃.ConclusionThe berberine of Cortex Phellodendri is extracted by Ultrasonic wave-Cellulase ,which can save time and enhance extract-efficiency, save organic solvent and reduce the use of energy .

　　Key words：Cortex Phellodendri;  Berberine;  Cellulase;  Ultrasonic wave

黄柏是芸香科植物黄皮树或黄檗的干燥树皮，黄柏具有抗病原微生物、抗溃疡、降压、抗心律失常等药理作用。临床常用于治疗中耳炎、皮肤感染、烧伤、慢性前列腺炎、急性细菌性痢疾、急性胃肠炎等病症［1］。经实验证明小檗碱是其主要成分之一。本实验主要利用正交设计研究纤维素酶、超声波对黄柏中小檗碱提取量的影响。

　　1  材料与仪器

　　1.1  材料

　　黄柏购自沈阳东北大药房，纤维素酶由沈阳农业大学生物工程实验室自制。所用试剂均为国产分析纯。

　　1.2  仪器

　　722-型光栅分光光度计（山东高密彩虹分析仪器有限公司）,KQ3200DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) 。

　　2  方法与结果

　　2.1  纤维素酶活力的测定

　　2.1.1 酶液配制准确称取500 mg纤维素酶，溶解后定容至100 ml容量瓶中，此酶液浓度为5 mg/ml。

　　2.1.2  葡萄糖标准溶液的配制准确称取100 mg分析纯无水葡萄糖，用蒸馏水溶解后，转移至100 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀。

　　2.1.3  葡萄糖标准曲线的制作取8支20 ml刻度试管标号后按表1加入各试剂。表1  葡萄糖标准曲线的制作（略）

将上述溶液混匀后，在沸水浴中煮沸5 min，冷却后定容至20 ml，摇匀。将分光光度计调零，在540 nm下测其A值。以每个试管中葡萄糖毫克数为横坐标，以对应的A值为纵坐标，绘制标准曲线。

　　2.1.4  样品测定取4支20 ml刻度试管，分别依次加入0.5 ml 0.05M柠檬酸缓冲液（pH 4.5），向各试管中加入0.5 ml酶液，在其中一支试管内立即加入1.5 ml 3，5二硝基水杨酸终止酶作用，作为空白与另3支试管一起在50 ℃水浴锅中保温1 h。取出后在后3支试管中加入3，5二硝基水杨酸，然后一起在沸水中煮沸5 min，冷却后定容至20 ml。以空白液调零。在540 nm下比色，由标准曲线查出所测A值对应的葡萄糖生成量。以上述条件，每小时由底物产生1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位。

　　2.1.5  滤纸酶活力计算滤纸酶活力（U/g）依据公式：滤纸酶活力（U/g）=葡萄糖生成量（mg）×酶液定容总体积×5.56/［反应液中酶液加入量（ml）×样品重（g）×时间（h）］，1 mg葡萄糖换算成μmol：1 000 μg/180 μg=5.56 μmol,经实验测得，纤维素酶作用后，3个试管的A值为0.013，0.011，0.012。取其平均值为0.012，通过葡萄糖标准曲线查得葡萄糖生成量为0.123 mg带入公式得：滤纸酶活力=547.104 U/g

　　2.2  小檗碱的提取及标准曲线的绘制

　　2.2.1  粗提将黄柏5 g碎成粉状，置烧杯中，加入1/10量的生石灰细粉，加水溶胀30 min后，再加入30倍量水浸泡24 h后纱布过滤，再用10 %的盐酸将滤液pH值调至2～3，然后加入滤液体积10 %的NaCl，放置过夜后抽滤，得到盐酸小檗碱的粗提物，此时还含有杂质。将盐酸小檗碱的粗提物用热水溶解并趁热抽滤，滤液冷却静止1 h抽滤得到盐酸小檗碱与掌叶防己碱等的混合物，至此黄柏的粗提完毕［2］。

　　2.2.2  盐酸小檗碱标准曲线的绘制精密称取盐酸小檗碱纯品10 mg，置50 ml容量瓶中，加95 %的乙醇溶解并定容至刻度，作为盐酸小檗碱标准溶液。精密称取此液0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 ml于50 ml容量瓶中，继续加95 %乙醇至刻度并在348 nm下测定吸光度值，y=0.805 5x-0.009 7。
　　2.3  纤维素酶-超声波对盐酸小檗碱提取率的影响取两组黄柏各5 g，粉碎。在一组样品中加入150 ml石灰水，在另一组中加入130 ml石灰水和20 ml浓度为5 mg/ml的酶液。第一组样品浸泡24 h后双层纱布过滤，第二组样品在60 ℃，功率为60 %的超声波清洗器里超声清洗90 min后双层纱布过滤，两组滤液用10 %的盐酸调pH 2～3，最后加入滤液体积10%的NaCl，放置过夜，抽滤，得两组盐酸小檗碱样品。用乙醇溶解并分别定容至50 ml，在348 nm下分别测其吸光度值，并在盐酸小檗碱标准曲线上查出各自的盐酸小檗碱。

　　2.4  提取条件的单因素考察

　　2.4.1  水浴温度对提取效果的影响

　　称取干燥的黄柏粗粉5 g左右，分别于 20，40，60，80，100 ℃时加入20 ml酶液，作用1.5 h，结果在60℃时提取量比较高。

　　2.4.2  水浴时间的确定

　　称取干燥的黄柏粗粉5 g左右，于 60 ℃时加入20 ml酶液，分别作用0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，结果水浴1.5 h时提取量比较高。表2  纤维素酶-超声波对盐酸小檗碱提取率的影响（略）

　　2.4.3  加酶量的确定称取干燥的黄柏粗粉5 g左右，于 60℃时加入酶液10，15，20，25，30 ml，分别作用1.5 h,结果加酶量为25 ml时提取量比较高。

　　2.4.4  超声功率的确定称取干燥的黄柏粗粉5 g左右，于 60℃时加入酶液20 ml，超声时间1.5 h，超升功率分别为40 %，50%，60 %，70 %，80 %，结果超声功率范围为60 %时，提取量比较高。

　　2.5  正交实验设计根据黄柏中盐酸小檗碱的提取条件，选定加酶量、温度、时间、超声功率4个因素，以L9（34）正交实验设计系统进行实验。因素水平见表3,正交表见表4。表3 因素及水平（略）表4  正交实验（略）

以上分析可以得出结论:各因素对实验指标(含量)的影响按大小次序来说应当是C(水浴时间)、D(超声功率)、A(加酶量)、B(水浴温度)，最好的实验方案应当是C3A2D3B2,即水浴时间2.5 h, 超声功率 80 %, 加酶 25 ml, 水浴温度 60℃。

　　2.6  利用薄层色谱法检测纤维素酶、超声波对盐酸小檗碱成分的影响制备硅胶薄层板一块，取盐酸小檗碱标准样品、未用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品、用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品和用纤维素酶-超声波提取的盐酸小檗碱样品各0.5μl，点样。按CHCl3∶MeOH∶冰HAC=7∶1∶2的比例配制展开剂，将点样后的薄层板放入层析缸中，待展开至规定距离时取出晾干。在可见与紫外灯下观察，未用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品、用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品和用纤维素酶-超声波提取的盐酸小檗碱样品薄层色谱图相同。说明，用纤维素酶提取的盐酸小檗碱的成分无变化。

　　3  讨论

　　3.1  为什么纤维素酶不会影响盐酸小檗碱的成分纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。纤维素酶只是破坏黄柏细胞的细胞壁，其细胞内部物质并不含有纤维素类物质，因此纤维素酶对其内容物的成分没有任何影响。所以，提取出来的盐酸小檗碱的成分并不会变化。

　　3.2  为什么超声提取会使黄柏中小檗碱的提取量增加且不影响其成分超声提取法是基于超声波的空化作用来加速物质分子运动的频率和速度、增加溶剂穿透能力，以提高药物溶出速度和溶出次数，从而有利于植物有效成分的浸出提取，而它的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，有利于中药中绝大部分有效成分的提取。超声提取还避免了高温加热对有效成分的破坏。

【参考文献】
  　　［1］韦正步.小檗碱临床应用概况［J］.西北药学杂志，1998，13(4)：178.

　　［2］卢艳花．中药有效成分提取分离技术［M］.北京：化学工业出版社，2004：71.

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