树脂吸附法分离苦瓜皂苷的工艺研究

amy54321 · 发表于 2014-8-17 21:00:21

【摘要】  目的研究苦瓜总皂苷的纯化方法。方法苦瓜醇提的浓缩液，通过经处理的NKA大孔吸附树脂，用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，UV法跟踪检测。结果80%乙醇洗液中苦瓜总皂苷的含量最高，可达到36%。结论 NKA大孔吸附树脂可有效地分离提取苦瓜总皂苷。

【关键词】  苦瓜皂苷提取大孔吸附树脂 NKA树脂

　　Study on Extraction Technology of Aponins from Momordica charantia L.by Macroporous Absorption Resin

　　Abstract：ObjectiveTo study on the extraction and purification methods of total Saponins in Momordica charantia L..MethodsMomordica Charantia L. ethanol isolated solutions passed through treated NKA macroporous absorption resin, and were made gradient elution with ethanol, then were detected with UVVIS. ResultsSaponins in 80% ethanol elution was the highest and over 36%.ConclusionNKA resin is greatly effective for the extraction and purification of Momordica charantia L. saponins.

　　Key words：Momordica charantia L.;  Saponins;  Extraction;  Macroporous adsorption resin;  NKA resin

　　苦瓜Momordica charantia L.属葫芦科苦瓜属，是人们生活中的一种常用蔬菜，同时也是功能食品原料。国内外不少学者从不同地区、不同品种苦瓜及其种子中分离出了多种生理活性物质，其中苦瓜中含有的苦瓜皂苷、生物碱、植物甾醇等成分具有显著的降糖作用［1～4］。鉴于苦瓜皂苷的功效及药用价值，本文以苦瓜为原料，采用吸附法提取苦瓜皂苷，确定了各项主要技术参数，以期对苦瓜皂苷提取的工业化生产提供科学依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器与试

　　剂山苦瓜，江都苦瓜种植基地；苦瓜皂苷对照品momordicoside A，实验室自制；大孔吸附树脂，商品号NKA、AB8和D101树脂，南开大学化工厂；LD52A离心机，北京医用离心机厂；玻璃层析柱：20 mm×600 mm；旋转蒸发器，上海精科实业有限公司；Cary紫外可见分光系统，美国VARIAN公司；薄层层析板G，青岛海洋化工厂分厂；玻璃点样毛细管，华西医科大学仪器厂；浓硫酸、冰醋酸和高氯酸等均为分析纯。

　　1.2  分析方法

　　1.2.1  苦瓜皂苷的含量测定［5］测定波长的选择：吸取 Momordicoside A甲醇标准液（1.274 mg/ml）80 μl,自然挥干溶剂，加5%草醛冰醋酸溶液0.2 ml，高氯酸0.8 ml，摇匀、密塞，于60℃水浴加热15 min，冰浴冷却，加冰醋酸5.0 ml，用紫外可见分光系统测定吸收曲线［6］。选用545 nm为测定波长。

　　建立回归方程：分别吸取40，80，120，160，200 μl甲醇标准液置10 ml具塞试管中，同上法测定吸收度。皂苷含量和吸收值经回归处理，回归方程为：A=0.005 8C 0.112 5，r =0.999 4，(n=5)。苦瓜皂苷含量在40～200 mg线性较好。

样品溶液制备：洗脱液减压回收乙醇至干，用少量甲醇溶解后，3 000 r/min离心后移置10 ml容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀备用。

样品皂苷质量分数的测定：同标准曲线制作方法，在最大吸收波长处测定吸光度，从标准曲线中找出对应的质量浓度。

总皂苷质量分数%=(样品液皂苷的质量浓度×样品液的体积/苦瓜粉末质量)×100%

　　1.2.2  洗脱液中总糖含量的测定洗脱液中总糖含量采用3,5二硝基水杨酸比色定糖法测定。采用无水葡萄糖配制标准溶液，制作标准曲线。于520 nm波长处测吸光度值，以吸光度值为纵坐标，以葡萄糖标准浓度为横坐标绘制标准曲线。糖的标准曲线见图2 (  Y= 2.936 5X-0.122 9,r=0.998 4)。

　　1.2.3  洗脱液中蛋白含量的测定采用Folin酚法测定洗脱液中蛋白质的浓度。以空白液为参比，在640 nm处比色测定。以吸光度值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线见图3（Y＝0.004 1X-0.032 6， r=0.996 7）。

　　1.2.4  苦瓜皂苷TLC［7］展开剂：氯仿甲醇水(65∶35∶10，5～10℃放置12 h以上）的下层液为展开剂。显色剂：甲液取水25 ml，缓慢加硫酸50 ml，放冷后，再加乙醇25 ml，摇匀；乙液：8%香草醛无水乙醇溶液。用时将5份甲液与1份乙液混合。临用现配，80℃烘至斑点清晰。

　　2  方法

　　2.1  树脂的筛选

　　2.1.1 大孔树脂的预处理先于吸附柱内加入相当于装填树脂体积0.4～0.5倍的乙醇，然后将新树脂投入柱中，使其液面高于树脂上端3 mm处，浸泡24 h；用2倍柱体积(BV)乙醇，以2 BV/h的流速通过树脂，并浸泡4～5 h；用乙醇以2 BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液不呈白色浑浊为止，并用水以同样流速洗净乙醇。用2 BV的2%HCl溶液，以4～6 BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2～4 h，而后用水以同样流速洗至流出水pH值为中性；用2 BV的2%NaOH溶液，以4～6 BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2～4 h，而后用水以同样流速洗至流出水pH值为中性。用去离子水冲洗浸泡，待用。

　　2.1.2  苦瓜皂苷吸附量的测定准确称取NKA，AB8和D101树脂0.998 7 g，苦瓜皂苷0.460 5 g，皂苷用20 ml水溶解，取出1 ml留下备用。将称好的树脂加入到剩余19 ml皂苷溶液中，摇匀，在冰箱中放置3 d(温度为5℃)，使树脂吸附饱和，从树脂吸附前和吸附后的溶液中分别取l00 μl 溶液加入10 ml容量瓶中，加4.9 ml甲醇稀释至50倍。吸取250 μl，同标准曲线项下测定吸附前后皂苷含量，利用其差值，计算出树脂的吸附容量。

　　2.2  NKA树脂静态吸附动力学实验称取NKA树脂5 g，加入50 ml浓度为4.02 mg/ml的苦瓜总皂苷溶液，于30℃下恒温振荡，每隔30 min测1次溶液中的总皂苷浓度，考察树脂吸附量随时间的变化。　2.3  NKA树脂动态吸附动力学实验将处理好的NKA树脂湿法装柱，取一定浓度的苦瓜总皂苷溶液以一定的流速流树脂柱，进行吸附，每10 ml收集1次，用分光光度法检测，至苦瓜总皂苷液的出口浓度与进口浓度相同为止。

　　2.4  苦瓜皂苷上柱液的准备

　　2.4.1  原料预处理称取一定量的鲜苦瓜，低温干燥后，80目粉碎，得到苦瓜粉。

　　2.4.2  提取［7］称取2 000 g干燥苦瓜粉，用5倍体积70%的乙醇溶液浸泡，在60℃回流3次，5 h/次，过滤得清液，挥发干净乙醇，浓缩至适当体积(80 ml)，备用。

　　2.5  树脂吸附法分离苦瓜皂苷取粗提的苦瓜皂苷40 ml清液上柱，静置后，先用2 BV去离子水洗去杂质，再用3 BV乙醇溶液洗脱皂苷，收集后待用。树脂反复使用需用3 BV甲醇再生。在提取过程中，分别考察了洗脱剂浓度和洗脱流速对苦瓜皂苷提取的影响。

在考察洗脱剂浓度影响时，取30 ml/次，粗提苦瓜皂苷清液原料，分别用30%，60%, 80%，90%乙醇溶液洗脱，洗脱流速为1.0 ml/min 。通过检测洗脱液中苦瓜皂苷、蛋白以及总糖含量，以得到高产、高纯的苦瓜皂苷为目的，确定吸附层析法提取苦瓜皂苷的最佳条件。

　　3  结果

　　3.1  树脂吸附容量测定结果本文以等量的3种树脂对相同起始浓度、相同体积的苦瓜皂苷溶液的平衡吸附量为依据，比较了3种树脂对苦瓜皂苷的吸附能力，从而进行筛选。表1列出了3种树脂对苦瓜总皂苷的平衡吸附量。表1  3种树脂对苦瓜总皂苷的吸附能力（略）

由表1可知3种树脂对苦瓜皂苷的乙醇溶液中皂苷的吸附能力，其中NKA树脂对苦瓜总皂苷有较大的吸附量，因此选择NKA树脂用于苦瓜总皂苷的分离。

　　3.2 NKA树脂静态吸附动力学实验结果图4为NKA树脂的吸附动力学曲线，根据相应的间隔时间计算出苦瓜总皂苷的平均吸附速率。由吸附动力学曲线可以看出，随着时间的延长，吸附量在增加，在8 h右基本达到平衡；吸附速率在2.5 h以后也逐渐平稳。

　　3.3  NKA树脂动态吸附动力学实验结果

　　3.3.1  流速对吸附曲线的影响对吸附效果有重要影响的一个参数是固液两相的接触时间，而影响固液接触时间的主要因素是料液的流速。因此，吸附过程中必须控制原料液的流速。图5为不同流速下NKA树脂的穿透曲线。从图中可以看出流速为1.0 ml/min，操作时间为40 min左右比较适宜。

　　3.3.2 进样浓度对吸附曲线的影响当流速为1 ml/ml时，分别以12，7.5，4.5 mg/ml的浓度进样，穿透曲线如图6所示。从图中可以随着进样浓度的增加，穿透时间减少。最终选择进样浓度7.5 mg/ml左右进行树脂吸附。

　　3.4  乙醇洗脱浓度对皂苷提取的影响从表1可以看出，随着乙醇浓度的增加，皂苷含量逐渐增加，但是80%以后皂苷含量降低。糖的含量变化不大。蛋白的含量虽逐渐增加，但其单位是μg/ml，因此总体变化不大。

不同浓度乙醇时洗脱苦瓜皂苷的TLC结果与苦瓜皂苷含量比色分析结果一致（图7），随着洗脱液中乙醇浓度的增加，各皂苷单体数目和含量都明显增多，当然杂质也增加。

最终确定80%乙醇为最佳洗脱浓度。

　　3.5  苦瓜皂苷提取率与纯度1 000 g苦瓜粉平均得到苦瓜皂苷粗品1.582 9 g，经比色分析皂苷含量0.5764 g。表2  不同浓度乙醇洗脱液中皂苷、蛋白和总糖含量(略)

皂苷得率＝0.576 4/100 0＝0.058%

皂苷纯度＝0.576 4/1.582 9＝36.414%

　　4  小结

本文研究了国产大孔吸附树脂（商品名NKA）提取和纯化苦瓜皂苷的方法。试验采用分光光度法测定了苦瓜皂苷的含量。通过对树脂吸附量的研究，发现NKA树脂对苦瓜总皂苷的吸附量较大，为110.72 mg/g。其分离纯化苦瓜皂苷的最佳进样浓度为7.5 mg/ml，最佳流速为1 ml/min。

实验还考查了乙醇洗脱浓度对苦瓜皂苷提取的影响，得出最佳乙醇洗脱浓度80%，所得皂苷纯度为36.414%，得率为0.058%。是一种简便实用的苦瓜皂苷提取方法。

苦瓜皂苷的有机溶剂提取法［6］和树脂吸附提取法都可以有效提取苦瓜皂苷。两方法相比较，前者纯度略高，但实验步骤较多，有机溶剂用量相对较大。而后者提取率略高且步骤相对简单，通过前者方法提取的苦瓜皂苷也可通过NAK树脂进一步纯化。

【参考文献】
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　　［5］吴茂玉.苦瓜啤酒的生产及有效成分的检测［J］.中国果菜,2003，1:20.

　　［6］崔恒林，徐斌，董英.苦瓜皂苷提取过程研究［J］.江苏大学学报（自然科学版），2004，25(5)：372.

　　［7］Oleszek W.A.Chromatographic determination of plant saponins, Journal of Chromatography A［J］.2002，967(1)：147.

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