|
|
【摘要】 目的优选当归补血汤的最佳提取工艺条件。方法以当归补血汤中阿魏酸含量为指标,对影响提取的重要因素A提取时间，B加水量，C提取次数进行L9(34)正交实验设计。结果最佳提取工艺为药材加12倍量水，提取两次，提取2 h/次。结论优选得到的提取工艺稳定可行。
【关键词】 当归补血汤 阿魏酸 正交实验
Abstract：ObjectiveTo study the best extraction process of Tangkuei Blood-supplementing decoction. MethodsUsing the orthogonal design which contained 3 factors (amount of water, extracted times, extracted hour) and 3 levels to determine the content of ferulic acid as the index of evaluation. ResultsThe optimum conditions for the extraction of ferulic acid were 12 times of water, extracted twice and each time lasted 2 hours. ConclusionThe extraction process for ferulic acid from Tangkuei Blood-supplementing decoction was stable and usable.
Key words：Tangkuei blood-supplementing decoction; Ferulic acid; Orthogonal design
当归补血汤出自李东垣《内外伤辨惑论》。该方由当归、黄芪两味药按1∶5的比例组成，是经典的气血双补名方，主治劳倦内伤、气弱血虚、阳浮外越、妇人经行、产后血虚发热头痛，以及疮疡溃后久不愈合等症。阿魏酸是中药当归中的主要有效成分之一，也是当归补血汤中的主要药效物质。现代药理学研究表明，阿魏酸具有抗氧化、增加冠脉血流量、抗血小板聚集等作用，临床上可用于治疗动脉粥样硬化，预防脑血栓形成［1］。本实验采用传统的水煎煮提取方式，取影响水煎煮提取的主要因素即加水量、煎煮时间、煎煮次数3个因素，各取3个水平进行L9（34）正交实验。以当归补血汤中的主要药效物质阿魏酸含量为指标，筛选当归补血汤的最佳提取工艺。
1 器材
1.1 仪器美国戴安Summit高效液相色谱仪系列（P680型四元低压梯度泵，UVD170U型紫外检测器，CHROMELEON 6.60色谱工作站）；旋转蒸发仪 RE52-99（上海亚荣生化仪器厂）；TDL80-2B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；BP211D电子分析天平（德国sartorius公司）。
1.2 药品与试剂阿魏酸标准品，购自中国药品生物制品检定所，批号：0773-9910；黄芪（产地内蒙古）、当归（产地甘肃）饮片均购自南京市药业股份有限公司。甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），纯净水，其余试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 正交实验设计根据传统汤剂的提取方法以及药材所含成分的理化性质的需要,选定提取时间、加水量、提取次数作为考察因素，以阿魏酸含量为指标，应用L9（34）正交实验设计进行实验，因素水平安排见表1。表1 因素水平（略）
2.2 样品溶液的制备称取当归5 g,黄芪25 g，共9份,按L9（34）正交实验表各列所示条件提取，滤过，合并滤液，于旋转蒸发仪上减压浓缩，所得浓缩液置100 ml的棕色容量瓶内，加入冰醋酸0.5 ml，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，定容，即得样品溶液。
2.3 阿魏酸含量测定方法
2.3.1 色谱条件色谱柱：Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇0.5％冰醋酸水溶液（35∶65）；流速：0.8 ml/min；检测波长：322 nm；柱温：40 ℃。
2.3.2 标准曲线的绘制取干燥恒重的阿魏酸对照品适量，精密称定，加水溶解，稀释制成不同浓度溶液，各精密吸取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为y = 8.796 3x + 1.091 3，r = 0.999 4。结果表明在2.908～23.264 μg/ml范围内阿魏酸的浓度与峰面积呈良好的线性关系。
2.3.3 样品溶液的预处理及测定采用甲醇沉淀法，取样品溶液10 ml，置50 ml棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度；精密吸取定容后溶液10 ml，3 000 r/min离心10 min；取上清液，0.22 μm微孔滤膜滤过，精密吸取20 μl注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表2。表2 正交实验结果（略）
2.3.4 回收率实验采用加样回收法，取已知阿魏酸浓度（10.768μg/ml）的样品溶液5份，分别加入精密称定的适量阿魏酸对照品，测定，结果平均回收率为97.63％，RSD为2.27％。
2.3.5 精密度实验取浓度为13.456 μg/ml对照品溶液，按含量测定项下方法，重复测定6次，记录峰面积值，结果RSD为0.85％，表明本法精密度良好。
2.3.6 稳定性实验取已知阿魏酸浓度（10.768 μg/ml）的样品，于室温下放置，分别于0，2，4，6，8 h按2.3.3项下方法处理测定。结果RSD为2.85％，表明本溶液8 h内稳定性符合要求。
2.3.7 验证实验根据筛选得到的最佳工艺提取3批样品，测定阿魏酸含量。 3 结果
3.1 正交实验结果正交实验结果见表2，利用STATISTICA软件对正交实验结果作方差分析，所得方差分析结果见表3。表3 方差分析（略）
直观分析结果表明，在所考察的影响因素中，重要性依次为A>C> B。A因素中A3>A2>A1；B因素中B3> B1> B2；C因素中C2>C3> C1。方差分析结果表明：A因素、C因素的影响具有显著性意义（P<0.05）；B因素的影响无显著性意义（P>0.05）。因此，确定最佳提取条件为A3 B3 C2，即加12倍量水，提取2次，2 h/次。
3.2 验证实验结果
根据筛选得到的最佳工艺A3 B3C2提取3批样品，测定阿魏酸含量，结果阿魏酸平均含量为（33.587±2.566μg/g)，验证实验结果与正交实验基本一致，说明所筛选的提取工艺条件稳定可行。
4 讨论
4.1 阿魏酸是中药当归中的主要有效成分之一，也是当归补血汤中的主要药效物质，故本研究以阿魏酸的含量为指标筛选当归补血汤最佳提取工艺。王宏洁等［2］研究发现阿魏酸见光极易分解，阿魏酸见光后2 h降低至相对含量的20%，故在标准品及样品的配制中使用棕色容量瓶，并在水煎液的制备过程中避免光线直射。阿魏酸为弱有机酸，在标准品溶液和样品溶液中加入一定量的冰醋酸，使得阿魏酸的稳定性显著增加，提高了分析结果的准确性。
4.2 目前，HPLC测定中药制剂中阿魏酸的文献报道较多，其中样品溶液的常规预处理方法有两种，萃取法［3］和甲醇沉淀法［4］，我们对这两种样品预处理方法的效果进行了比较。
萃取法操作如下：取样品溶液10 ml，于70℃水浴蒸干；用5％Na2CO3水溶液20 ml转移置分液漏斗中，乙醚洗涤2次，20 ml/次，保留水相；盐酸调pH值至1～2；乙醚萃取3次，20 ml/次；合并乙醚层，50 ℃水浴蒸干；残渣用甲醇溶解转移置10 ml棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，0.22 μm微孔滤膜滤过，精密吸取20 μl注入液相色谱仪，测定，即得。甲醇沉淀法操作如
2.3.3所示。两种预处理方法HPLC测定结果见图1。
从图1中可见，萃取法得到图谱中杂质大部分已经被除去，杂质峰数目较少，但阿魏酸柱效相对较低，色谱峰面积较小。甲醇沉淀法得到的图谱中阿魏酸柱效较高，色谱峰面积大，虽然在杂质峰较多，但与阿魏酸分离度较好，不影响分析结果。并且从操作的角度讲，萃取法操作过程繁琐，样品需要反复的洗涤与萃取，因而易造成阿魏酸的损失。甲醇沉淀法只经过一步离心操作，过程简单，加入甲醇后，药液滤过更容易。因此，我们最终选用甲醇沉淀法作为当归补血汤水提液样品的预处理方法。
【参考文献】
［1］季宇彬. 中药抗衰老有效成分药理与应用，第1版［M］.哈尔滨： 黑龙江科学技术出版社，2001：174.
［2］王宏洁，沈 欣，杨 健. 高效液相色谱法测定当归补血汤中阿魏酸的含量［J］.中国实验方剂学杂志，1998，4（5）：9.
［3］胡传芹，宋金春，曾俊芬，等.高效液相色谱法测定复方当归注射液中阿魏酸含量［J］.中国医院药学杂志，2005，25（5）：441.
［4］陈 璐，陶婷婷，王天志. RP-HPLC测定藏药柳茶中阿魏酸和异阿魏酸的含量［J］.华西药学杂志， 2006，21（2）：196. |
|
|Archiver|手机版|小黑屋|魅优论文范文网
( 琼ICP备10200388号-7 )
发表于 2014-8-17 21:02:13
收藏
转播
支持
反对