川芎嗪注射液对博莱霉素致肺纤维化大鼠转化生长因子干预作用的研究

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【摘要】  目的研究川芎嗪注射液对肺纤维化大鼠转化生长因子β1（TGF-β1）的干预作用。方法气管内注入博莱霉素A5复制肺纤维化动物模型，造模第2天川芎嗪大、中、小剂量组每日开始腹腔注射川芎嗪注射液至28天，剂量分别为250，150，40 mg/（kg·d）。应用放免及免疫组织化学方法，检测第14，28天时血清TGF-β1及第28天时肺组织中以上指标的表达。 结果川芎嗪注射液能降低肺纤维化大鼠血清及肺组织TGF-β1的表达，降低肺纤维化增生程度，其中以川芎嗪大剂量组效果最为明显。结论降低肺纤维化大鼠TGF-β1的表达，可能是川芎嗪注射液发挥治疗作用的机理之一。

【关键词】  川芎嗪注射液 肺纤维化 转化生长因子


    肺纤维化是以慢性进行性弥漫性肺间质纤维化和肺生理功能障碍为特点的肺间质性疾病, 其主要病理特点是：早期弥漫性肺泡炎,后期大量成纤维细胞病理性增生及基质胶原进行性积聚,并取代正常的肺组织结构。对于本病目前尚缺乏有效的治疗方法,为进一步分析其分子作用机制,我们采用博莱霉素复制肺纤维化动物模型,通过放免及免疫组织化学方法,观察本模型中血清及肺组织转化生长因子（TGF-β1）的变化,探讨川芎嗪注射液对以上指标的影响。

　　1  器材

　　1.1  动物70只清洁级Wistar雄性大鼠体重150～170 g,由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2003-1-003，合格证编号：DK0509103。

　　1.2  药品博莱霉素A5 (BLM)由天津太河制药有限公司生产；川芎嗪注射液(40 mg/2 ml,国药准字H11020960，批号:05060601)由北京市永康药业有限公司生产。

　　1.3  试剂与仪器

　　放免试剂盒购于上海市军医学研究所；放射免疫计数器为中国科技大学实业总公司产品;TGF-β1多克隆抗体购自美国Santacruz公司;SP试剂盒购自美国Zymed公司。HPLAS-1000高清晰度彩色病理报告分析仪、计算机图像处理系统及相应软件购自德国Opten公司。

　　2  方法

　　2.1  模型分组、复制及标本留取70只雄性大鼠除12只作为空白组外,其余58只乙醚麻醉后,经颈正中切口分离气管,按5 mg·kg-1（用生理盐水稀释为5 mg·ml-1）气管内注入博莱霉素A5后,立即将动物直立并旋转,使药液在肺内分布均匀。注入药物过程中,由于操作失误导致大出血等原因死亡4只,其余54只随机分为4组：模型组14只、川芎嗪大剂量组（简称“大剂量组”）14只、川芎嗪中剂量组（简称“中剂量组”）13只、川芎嗪小剂量组（简称“小剂量组”）13只。造模第2天大剂量组、中剂量组、小剂量组开始每日腹腔注射川芎嗪注射液,剂量分别为250，150，40 mg/（kg·d）。模型组腹腔注射中剂量组等容积生理盐水；空白组12只大鼠分离气管后,气管内按1 ml/kg注射生理盐水,并于造模第2天开始每天腹腔注射中剂量组等容积生理盐水。实验第14天时每组随机取10只大鼠,股静脉采血离心,取血清,-20℃冰箱保存备用。至实验末即第28天时将大鼠麻醉后留取：①血清：股静脉采血,取血清。②肺组织标本：肺左下叶置于4%甲醛固定液中保存,常规石蜡包埋、切片(4 μm),进行免疫组织化学鉴定。

　　2.2  血清学指标测定方法采用放免法测定第14及28天血清中TGF-β1的表达。

　　2.3  肺组织指标测定方法

　　2.3.1  免疫组织化学检测用SP法测定TGF-β1的表达,一抗为兔抗大鼠TGF-β1,按1∶100稀释,以磷酸盐缓冲液替代一抗作为阴性对照,正常山羊血清封闭,滴加生物素标记的第二抗体,DAB显色,苏木素复染, 常规脱水、透明、封片。

　　2.3.2  免疫组织化学染色半定量分析空白组取6只大鼠标本,其余各组每组选取7只大鼠标本,每个标本随机观察一张切片,每张切片随机选取上、中、下、左、右5个视野,摄像并存入计算机,采用HMIAS-2000型高清晰度彩色病理图象分析系统。用阳性染色面积和每个视野面积的百分比表示该成分的相对含量。

　　2.4  统计学方法采用SPSS11.5 for windows统计软件,所有数据均采用±s表示,采用单因素方差分析法对实验结果进行统计学分析。　3  结果

　　3.1  大鼠死亡情况至实验末模型组、大剂量组各死亡2只,中剂量组、小剂量组各死亡1只,其原因可能与博莱霉素A5的毒副作用及气管切口处感染有关。

　　3.2  大鼠体重变化情况结果表明,第1天时各组之间无明显差异（P＞0.05）；第14天时,模型组明显低于空白组（P<0.01）；川芎嗪大、中、小剂量组明显高于模型组（P<0.01）；川芎嗪大、中、小剂量组之间无明显差异（P＞0.05）；第28天时,模型组明显低于空白组（P<0.01）；川芎嗪大、小剂量组明显高于模型组（P<0.01；P<0.05）,川芎嗪中剂量组与模型组无明显差异（P＞0.05）。川芎嗪大剂量组高于中、小剂量组（P<0.05）。提示随着肺纤维化病程延长，川芎嗪大剂量组体重增长较明显，具有一定优势。结果见表1。表1  第1，14，28天时各组大鼠体重变化情况比较（略）

　　3.3  血清中TGF-β1含量的测定与空白组比较,模型组第14天、28天时血清中TGF-β1含量均明显升高（P<0.01）；川芎嗪大、中、小剂量组与模型组比较其含量明显降低（P<0.05或P<0.01）。第14天时大剂量组TGF-β1含量与中剂量组比较无明显差异（P＞0.05）,与小剂量组比较明显降低（P<0.01）；第28天时大剂量组TGF-β1含量明显低于中、小剂量组（P<0.05；P<0.01）；提示大剂量组明显优于中、小剂量组。结果见表2。
表2  第14，28天血清中TGF-β1含量的测定（略）

　　3.4  各组大鼠第28天时肺组织TGF-β1蛋白表达、分布及半定量分析空白组在少数细支气管黏膜上皮细胞的胞浆中TGF-β1有比较弱表达;模型组在支气管黏膜上皮细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞中均有高表达。川芎嗪大、中、小剂量组在支气管黏膜上皮细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞中均有比较弱的表达,其中川芎嗪大剂量组表达更弱。

    半定量分析结果表明，与空白组比较,模型组肺组织中TGF-β1相对含量均明显升高（P<0.01）；川芎嗪大、中剂量组与模型组比较其含量明显降低（P<0.01或P<0.05）；小剂量组与模型组比较无明显差异（P＞0.05）；大、中、小剂量组之间无明显差异（P＞0.05）。但大剂量组相对含量的数值低于中、小剂量组。提示大剂量组有一定优势。 结果见表3。表3  第28天肺组织TGF-β1相对含量的比较（略）

　　4  讨论

    肺纤维化是由多种原因引起的一类间质性疾病。肺组织的细胞外基质与肺纤维化关系最为密切［1］。细胞外基质成分在一定条件下的过度沉积,最终形成肺纤维化。TGF-β1是迄今发现的最强的细胞外基质沉积促进剂,它能作用于多个环节,刺激各种细胞外基质成分的合成和沉积,包括上调基质成分的转录、翻译和翻译后步骤,促进基质蛋白和受体的产生,减少基质降解酶以及增加降解抑制剂的合成,导致纤维化的形成。川芎嗪是由伞形科藁本属植物川芎中分离提纯出的生物碱单体,是传统的活血化淤药物。近年来研究发现川芎嗪可以改善微循环,对抗脂质过氧化反应,减轻纤维化发病过程中的脂质过氧化连锁反应［2］,抑制成纤维细胞增生以及Ⅰ、Ⅲ型胶原基因转录,对肺纤维化有一定治疗作用［3］。故本实验采用博莱霉素复制肺纤维化动物模型,通过放免及免疫组织化学方法,观察本模型中血清及肺组织TGF-β1的变化。
  
    实验结果表明,在应用博莱霉素A5后血清及肺组织中TGF-β1的表达升高,肺纤维化形成,而川芎嗪注射液能降低肺纤维化大鼠血清及肺组织TGF-β1的表达,降低肺纤维化增生程度,其中以川芎嗪大剂量组效果最为明显。提示应用川芎嗪常规剂量治疗肺纤维化难以发挥较好的疗效，大剂量治疗肺纤维化具有一定优势。本研究提示川芎嗪注射液能降低肺纤维化大鼠TGF-β1的含量,,从而阻断该细胞因子的致纤维化效应,延缓肺纤维化的进程,其具体作用机制有待于进一步研究。



【参考文献】
  　　［1］Cook D N, Brass D M, Schwartz D A, et al. A matrix for new ideas in pulmonary fibrosis［J］.Am J Respir Cell Mol Biol, 2002,27:122.

　　［2］边晓丽,陈学敏,刘艳霞,等.川芎嗪及其衍生物对羟自由基的清除作用［J］.中国医院药学杂志,2003,23(11):678.

　　［3］史大卓.川芎嗪的药理作用诌议［J］.中国中西医结合杂志,2003,23(5):377.