高效液相色谱法测定乌龙丹中人参皂苷Rg1的含量

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【摘要】  目的建立测定乌龙丹中人参皂苷Rg1含量的方法。方法应用高效液相色谱法测定人参皂苷Rg1的含量。色谱条件：流动相为乙腈∶0.2%磷酸（83∶17），检测波长为203 nm，流速1.0 ml/min。结果人参皂苷Rg1在0.404～4.040 μg范围之内呈良好的线性关系，r=0.999 6。平均回收率96.34%，RSD=2.37%。结论 此法简便、准确，重现性好，可用于测定乌龙丹中人参皂苷Rg1的含量。

【关键词】  乌龙丹 人参皂苷Rg1 高效液相色谱

　　Determination of Ginsenoside Rg1 in Wulongdan by HPLC

　　Abstract：Objective To estabish a method for determination of ginsenoside Rg1 in Wulongdan. MethodsGinsenoside Rg1 was determined by HPLC.The mobile phase was acetonitrile- 0.2 moL/L phosphoric acid (83∶17) at a flow of 1.0 ml/min, and detection wavelength was 203nm. ResultsThe determination method for ginsenoside Rg1 had a good linear relationship in the range of 0.404～4.04 μg, r=0.999 6. The average recovery was 96.34%, RSD=2.37%. ConclusionThis method is simple, accurate and reliable, which can be used for determination of the contents of ginsenoside Rg1 in Wulongdan.

　　Key words：Wulongdan;   Ginsenoside Rg1;   HPLC

    乌龙丹系南方医科大学臧堃堂教授临床经验方，由黄芪、生晒参、首乌、葛根、当归、川芎等多味中药组成，具有益气活血、补肾填髓、化淤通络等功效，临床用于治疗缺血性心脑血管疾病，疗效肯定［1,2］。本课题组前期已在其质量控制方面做了大量工作［3］。考虑到本品组方复杂，生晒参是其主要药物，为了更好地控制该药品的内在质量，确保用药安全有效，本实验进一步采用高效液相色谱法对该制剂中主要成分人参皂苷Rg1进行含量测定。

　　1  材料与仪器

    乌龙丹流浸膏及各阴性对照品。乌龙丹处方：黄芪30 g，生晒参10 g，白术10 g，当归10 g，川芎10 g，丹参20 g，水蛭3 g，地龙10 g，葛根30 g，制首乌20 g，女贞子20 g，石菖蒲10 g，全蝎6 g，僵蚕10 g（由南方医科大学中医药学院中药房提供）。以上方药共煎，浓缩成流浸膏(1ml浸膏≈2.5 g原药材)。阴性对照品自制。人参皂苷Rg1（批号：0703-200015），所用试剂乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；甲醇为色谱纯(天津市康科德科技有限公司)，其他试剂均为分析纯，水为纯净水。日本岛津公司Shimadzu高效液相色谱仪,ALS 自动进样器，DAD紫外检测器，Millennium 32 色谱工作站。

　　2  方法与结果

　　2.1  人参皂苷Rg1对照品溶液的制备精密称定人参皂苷Rg1 5.05 mg，用甲醇溶解定容至25 ml量瓶中，即得。

　　2.2  样品溶液的制备精密吸取乌龙丹14 g，置50 ml具塞三角瓶中，精密加入70%乙醇至量，称重，立即超声30 min，静置10 min，补足原重量，滤过，精密吸取续滤液25 ml，减压回收乙醇至干，残渣以水10 ml溶解，水溶液置50 ml分液漏斗中，水溶液过大孔树脂（15 cm，φ1 cm，干法装柱），以水100 ml，30%甲醇100 ml，甲醇100 ml洗脱，收集甲醇液，并减压回收至干，再用甲醇定容至5 ml量瓶中，即得样品溶液。

　　2.3  缺生晒参溶液的制备取缺生晒参样品，按样品溶液的制备方法制成缺生晒参阴性溶液。　　2.4  色谱条件色谱柱为Kromail C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为乙腈：0.2%磷酸（83∶17），检测波长203 nm，流速1.0 ml/min，进样量10 μl。在此色谱条件下，取人参皂苷Rg1对照品溶液、供试品溶液、缺生晒参阴性对照品溶液各10 μl，进行HPLC测定，结果见图1～3。可见与对照品保留时间一致，并且人参皂苷Rg1与其他组分达到较好地分离。而阴性未出现该峰，不干扰此成分的测定。

　　2.5  人参皂苷Rg1标准曲线制备分别精密吸取人参皂苷Rg1对照品溶液(0.202 mg/ml)2，4，8，10，15，20 μl进样，按上述方法测定，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制工作曲线。回归方程为：Y=122 262X+1 330.2，r=0.999 1，r=0.999 6，线性范围为0.404～4.040 μg。

　　2.6  精密度实验以同一对照品溶液连续重复进样5次，以人参皂苷Rg1峰面积的RSD=0.23%（n=5）。结果表明精密度良好。

　　2.7  重现性实验按前文所述“含量测定”方法，对同一批样品，分别制备5份供试品溶液，各吸取10 μl，进行HPLC法测定，结果人参皂苷Rg1含量为0.159 3 mg/g，RSD＝1.57%。表明本法重现性良好。

　　2.8  稳定性实验取同一供试品溶液照含量测定方法，每隔2 h进样测定，共5次，结果表明，供试品溶液在8 h内基本稳定，RSD为0.27%（n=5）。

　　2.9  回收率实验采用加样回收实验，精密称取已知含量的样品（人参皂苷Rg1含量为0.1593 mg/g），精密加入一定量的对照品，分别为人参皂苷Rg1对照品溶液（0.202 mg/ml）4，5.5，6.5 ml按样品含量测定方法测定含量，计算加样回收率，平均加样回收率为96.34%，RSD为2.37%（n=9）。结果见表1。表1  回收率实验结果（略）

　　2.10  样品的含量测定取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算，5批样品含量的测定结果见表2。表2  人参皂苷Rg1的含量测定结果（略）

    根据上述测定结果，暂定供试品每g含人参皂苷Rg1不得少于0.15 mg。

　　3  讨论

    实验中曾用多种流动相对乌龙丹流浸膏组分的分离情况进行考察，结果以乙腈∶0.2%磷酸（83∶17）为流动相时，人参皂苷Rg1的峰型较好，分离效果好，杂质干扰少，故选用其为本法的流动相。

    乌龙丹流浸膏采用水提取法，比较切合临床实际，但可能影响了人参皂苷Rg1的提取率，因此，该制剂的提取工艺有赖临床使用情况最后确定。本实验采用HPLC法测定乌龙丹流浸膏中人参皂苷Rg1的含量，证明此方法简便、准确，重现性、回收率均较好。



【参考文献】
  　　［1］钟 洪,吴绪祥. 乌龙丹的临床运用［J］.现代中西医结合杂志，2000, 9(4)：335.

　　［2］彭 康,臧坤堂. 乌龙丹治疗急性脑梗死的临床疗效及其经颅彩色多普勒超声分析［J］.中国中西医结合急救杂志，1999, 6(9)：389.

　　［3］郭建生,沈 群,汪小根,等. 乌龙丹流浸膏质量标准研究［J］.时珍国医国药，2005,16(12)：1273.