乳核速消胶囊对大鼠乳腺增生病治疗作用的实验研究

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【摘要】  目的观察乳核速消胶囊对实验性大鼠乳腺增生病的治疗作用 ,探讨其疗效和作用机理。方法用肌注外源性苯甲酸雌二醇及黄体酮的方法复制大鼠乳腺增生模型 ,观察各组大鼠乳腺组织变化 , 用放射免疫法检测血清生殖激素三项（E2，P，PRL）,免疫组化方法观察乳腺组织中雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的变化。结果乳核速消胶囊治疗组大鼠的乳腺增大和腺泡、导管增生均显著轻于模型组;血浆雌二醇、乳腺组织中 ER 和 PR 含量显著低于模型组;血浆黄体酮含量则显著高于对照组。结论乳核速消胶囊对大鼠乳腺增生具有抑制作用 ,其机理与调节实验性大鼠性激素的血浓度及其受体的表达有关。

【关键词】  乳腺组织增生 乳核速消胶囊

　　　Abstract:ObjectiveTo study the function mechanism of the traditional medicine - Ruhesuxiao Capsules on experimental mastoplasia rat.MethodsThe progesterone and estrogen were used to set up the rat mastoplasia model . Serum hormone (E2 P PRL) was measured，the change of rat mastoplasia pathology was observed by light microscope,the expression of ER，PR in breast tissue was observed by immunohistochemical technology.ResultsCompared with the model group, the effects of treatment groups were more obvious in improving the rat's mastoplasia pathology structure,regulating the E2,P,PRL in serum,decreasing the expressions of ER ,PR in breast tissue.ConclusionRuhesuxiao Capsules can inhibit the astoplasia .It is possible that the function mechanism is related to regulating the level of hormone in serum and reducing the expressing of ER,PR in breast tissue .

　　Key words:Ruhesuxiao Capsule;  Hyperplasia of mammary glands

    乳核速消胶囊是宁夏中医研究院中医妇科研制的纯中药制剂，由夏枯草、山慈姑、生牡蛎、生麦芽、海藻、鹿角霜等15味中药组成，具有疏肝理气、软坚散结、活血化淤、调经止痛之功效，临床上用于治疗乳腺增生病效果良好。我们对其作用机制进行实验研究。现报道如下。

　　1  材料

　　1.1  动物Ｗistar雌性未孕大鼠50只，体重180～200 g，由宁夏医学院动物中心提供。合格证号：宁医动字第13-201号。

　　1.2  药物乳核速消胶囊由宁夏中医研究院中药制剂室提供；苯甲酸雌二醇（2 mg/支）和黄体酮（10 mg/支）均上海通用药业股份有限公司生产，批号分别为H31021114，H31021401；乳癖消，辽宁护士药业（集团）有限责任公司产品，批号为Z21021823。

　　1.3  试剂由武汉博士德生物制品有限公司提供的放射免疫试剂盒、免疫组化试剂盒。

　　2  方法

　　2.1  造模及给药方法将Ｗistar大鼠50只，经实验室常规饲养观察3 d后随机分成5组，即空白对照组、模型对照组、乳癖消组、乳核速消胶囊高剂量组、乳核速消胶囊低剂量组。每组10只。参照有关文献［1］，除空白对照组外，其余各组每只按体重0.5 mg/kg给大鼠后肢后外侧肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液(左右后肢交替肌肉注射，以免肌肉硬结，影响药物效果)，1次/d，连续20 d。随后按每只5 mg/kg肌注黄体酮，1次/d，连续5 d。空白对照组动物每日在后外肢后外侧注射生理盐水0.1 ml/只，1次/d，连续注射25 d。造模成功后开始灌胃给药。空白组、模型组给予生理盐水2 ml/只；乳核速消胶囊高、低剂量组每只分别给予乳核速消胶囊0.56，0.28 g/kg；乳癖消组每只给予乳癖消0.43 g/kg；以上各组药物分别用生理盐水配成所需浓度，灌胃量为2 ml/只，连续20 d。

　　2.2  检测项目

　　2.2.1  末次给药3 d后，摘眼球取血2～3 ml，用放射免疫法测定雌二醇（E2）、孕酮（P）、催乳素（PRL）。

　　2.2.2  经乳头基底部最大切面取下该对完整的乳腺，用10%的甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，在光镜下观察计数每个小叶腺泡数，导管上皮增生数，求其平均值。

　　2.2.3  通过免疫组化方法观察ER，PR的表达情况，取乳腺组织于10%甲醛溶液固定，常规方法进行石蜡包埋。石蜡切片脱蜡脱水；3％H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。5%～10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10 min，倾去血清，勿洗；滴加适当比例稀释的一抗（大鼠ER或PR单克隆抗体，IgG）, 37℃孵育 1～2 h  或4℃过夜。PBS冲洗，5 min×3次；滴加适当比例稀释的生物素标记的二抗（用1％BSA－PBS稀释的兔抗大鼠IgG），37℃孵育10～30 min；PBS冲洗，5 min×3次；滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10～30 min； PBS冲洗，5 min×3次；DAB显色剂显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。

　　2.3  统计学分析

　　生殖激素的量、导管上皮层数、小叶腺泡数，PR，ER表达积分均采用均数±标准差表示。各组数据之间的比较采用方差分析。　　3  结果

　　3.1  各组大鼠血清中生殖激素的测定结果见表1。表1  各组大鼠血清中生殖激素的测定结果（略）

    表1结果所示，模型对照组动物血液中的催乳素、雌二醇的含量均显著高于正常对照组（P<0.05或P<0.01），孕酮则显著低于正常对照组(P<0.05或P<0.01);经乳核速消胶囊及对照药物的治疗后，大鼠血清催乳素、雌二醇与模型对照组比较均有所降低（P<0.05或P<0.01）。

　　3.2  乳腺导管上皮层数腺泡变化观察经药物治疗的各组，乳腺增生的程度均有不同情况的改善，与模型对照组比较有不同程度的的改善。各组乳腺导管上皮增生及小叶中腺胞数比较见表2。表2  各组大鼠乳腺导管上皮层数腺泡数比较（略）

    表2提示，模型对照组与空白对照组相比导管上皮层数、腺泡数明显增多，有显著性差异(P<0.01)。而乳核速消剂组经对照药治疗后，导管上皮层数、腺泡数明显减少，与模型对照组相比有显著差异(P<0.01)，且乳核速消高剂组优于乳癖消组，有较显著性差异(P<0.01)。

　　3.3  大鼠乳腺组织PR，ER的表达ER，PR阳性判断标准［2］为乳腺导管和小叶上皮细胞核和/或细胞浆着色时为阳性。阳性细胞率<20%者为（-），阳性细胞率不足20%,但局部区域有少量较强着色的阳性细胞者为(±)，阳性细胞率>20%者且阳性细胞数由少至多,着色由浅至深为+,++,+++,++++, 并分别计1，2，3，4，5，6分，积分愈高表明ER，PR含量愈高。各组ER，PR的积分见表3。表3  各组大鼠 PR 积分比较（略）

    表3提示，模型对照组与正常对照组比较ER，PR积分有显著意义，乳核速消高、低剂量组与模型对照组相比也分别有显著和极显著的差异；乳核速消高剂量组与乳癖消组相比也有显著性差异(P<0.05)，而乳核速消低剂量组与该组相比无显著性差异。

　　4  讨论

　　4.1  动物实验模型的选择从实验结果看，模型对照组的大鼠乳头明显高于正常对照组，有显著性差异(P<0.01)；经病理切片观察发现，模型对照组的乳腺导管上皮层数、小叶腺泡数均高于正常对照组，有显著性差异（P<0.01），而且乳腺增生呈多种类型，如导管增生、腺泡增生和囊性增生等，都表明成功复制了大鼠乳腺增生模型。该结果与文献报道的一致［3］，说明该种模型的可比性强，模型的制作方法是成功的。

　　4.2  乳核速消胶囊治疗乳腺增生病的机制综合本课题的其它动物实验资料，乳核速消胶囊主要是通过以下几个方面达到治疗作用的：

　　4.2.1  调节血清性激素的水平乳腺增生病的发生由于内分泌失调的观点已为大多数学者公认。一般认为主要为E2(雌二醇)绝对或相对增高，P(孕酮)分泌相对或绝对不足，失去制约E2与保护乳腺组织的作用，E2/P比例失调，同时PRL(催乳素)的升高亦直接刺激乳腺组织，并进一步刺激E2的合成和抑制P的分泌，使乳腺组织不断处于E2的刺激之中，而引起乳腺组织增生。本实验中结果表明，经过乳核速消胶囊治疗，动物血液中垂体促乳素和雌二醇与模型对照组比较均有所降低（P<0.01或P<0.05），从而使E2/P的比例接近生理状态。

　　4.2.2  降低乳腺组织PR的含量一般认为PR激素受体是雌激素对靶细胞发挥生理效应的媒介，当孕酮含量升高时经PR的介导，通过完整的PR系统，使PR合成进一步增加，对PR的依赖性、敏感性同步增加，引起乳腺上皮细胞的增生和细胞功能活跃，从而引起乳腺组织增生。本实验中海珠消癖丸高剂量组PR的积分明显低于模型组（P<0.01），因而可以推测乳核速消胶囊是通过降低大鼠乳腺组织PR含量，使乳腺组织局部对P的敏感性下降，从而减弱雌激素在靶细胞上的生物学效应，产生抑制和治疗乳腺增生作用。

　　4.3  存在问题与展望通过动物实验研究表明，中医药在治疗乳腺增生病方面确有重要作用，且效果显著。既能从组织病理上修复增生的乳腺，也可以通过调整机体内源性激素水平、激素受体免疫功能、改善血液流变等直接或间接作用靶器官-乳房，达到治疗的作用。今后应充分发挥中医药的优势，努力研制出符合中医证候的模型，完善模型动物的观察指标，做到治疗的标准化、规范化，力争从分子与超微结构水平上阐明中药的药效机理。



【参考文献】
  　　［1］谢素媛，凌文津.乳腺病肝郁气滞证的机理探讨［J］.广西中医药，2002，25(3)：31.

　　［2］黄月玲，文瑞成，文永芳，等.中药对乳腺增生病疗效的动物试验研究［J］.广州医学院学报，2002，30(1)：29.

　　［3］黄月玲，文断成，韦永芳，等.大鼠乳腺增生模型的建立［J］.广东医学，2002，23(4)： 362.

　　［4］唐汉钧.乳腺病研究新近展［M］.上海:上海中医药大学出版社，2004：182.