瑞香狼毒提取物和肿瘤坏死因子对肺癌基因蛋白表达的影响

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【摘要】  目的探讨瑞香狼毒和肿瘤坏死因子(TNF)对肺癌细胞基因蛋白表达的影响。方法用瑞香狼毒水提取物和TNF分别及联合处理肺癌细胞株NCI-H157和NCI-H446，用免疫组织化学SP法分别检测用药前后肺癌细胞中多药耐药相关蛋白(MDM2)、肺耐药蛋白(LRP) 和热休克蛋白27(HSP27)的表达状况。通过形态学图像分析，比较瑞香狼毒和TNF用药前后三种基因蛋白表达的差异。结果用药前后两种肺癌细胞株3种基因蛋白表达情况如下：①瑞香狼毒组NCI-H446细胞株用药后LRP和MDM2阳性细胞灰度值均高于用药前(P<0.05)；HSP27的表达用药前后差异无显著性(P>0.05)。NCI-H157细胞株用药后LRP和HSP27阳性细胞灰度值均高于用药前 (P<0.05)；MDM2的表达用药前后差异无显著性(P>0.05)。②TNF组NCI-H446细胞株用药后LRP阳性细胞灰度值高于用药前 (P<0.05)；HSP27和MDM2的表达用药前后差异均无显著性(P>0.05)。NCI-H157细胞株用药后LRP，MDM2和HSP27阳性细胞灰度值均高于用药前(P<0.05),其中LRP具有高度显著性(P<0.01)。③联合用药组NCI-H446细胞株用药后LRP和MDM2阳性细胞灰度值均高于用药前(P<0.05),HSP27的表达用药前后差异无显著性(P>0.05)。NCI-H157细胞株用药后LRP、MDM2和HSP27阳性细胞灰度值均高于用药前 (P<0.05),且LRP和HSP27差异具有高度显著性(P<0.01)。结论瑞香狼毒提取物和肿瘤坏死因子对两种肺癌细胞株的某些基因蛋白的表达具有抑制作用；两种药物联合应用对基因蛋白的表达有明显的抑制作用。

【关键词】  瑞香狼毒 肿瘤坏死因子 肺癌细胞株 基因蛋白

　　The Effects of  Extracts from Ruixianglangdu and Tumour Necrosis Factor of Expression of Gene Protein in Two Lung Carcinoma Cell

　　Abstract:ObjectiveTo research the effect of extracts from Ruixianglangdu and tumour necrosis factor(TNF) on expression of gene protein .MethodsTwo lung carcinoma cell strains were treated with extracts from Ruixianglangdu and TNF,the expressions of MDM2,LRP and HSP27 in lung cancer cell strains were detected with immunohistochemistry SP assay before and after being treated respectively. To compare the difference of expression of three kinds of gene protein with morphological image assay.ResultsThe difference of expressive intensity of MDM2,LRP and HSP27 between before and after being treated with extracts from Ruixianglangdu and TNF in two lung carcinoma cell strains as follows. ①In Ruixianglangdu group:in lung carcinoma cell strain NCI-H446 the expressive intensity of LRP and MDM2 were higher than that before treated(P<0.05),except HSP 27(P>0.05).②In NCI-H157 the expressive intensity of LRP and HSP 27 were higher than that after treated(P<0.05)，except MDM2 (P>0.05). ③In TNF group: the expressive intensity of LRP was higher than that before treated with TNF(P<0.05).The difference of expressive intensity of HSP27,MDM2 were inapparent before and after treated with TNF(P>0.05). ④In combination group: the restraining effect of expression of gene protein(MDM2,LRP and HSP27) were consuming in NCI-H446 and NCI-H157 strains(P<0.01). ConclusionThe extracts of Ruixianglangdu and TNF restrain the expression of certain kinds of gene protein in two lung carcinoma cell strains. The restraining effect of expression of gene protein are consuming in combination group.

　　Key words:Ruixianglangdu;  Tumour necrosis factor（TNF）；  Lung carcinoma cell strains;  Gene protein

    受人口老龄化、环境污染、吸烟、职业等因素的影响，肺癌已成为我国癌症死亡病因的首位，其发病率及病死率均呈显著上升趋势。由于肺癌患者早期诊断比较困难，多数患者确诊时已属晚期，失去手术机会。因此化疗仍是多数肺癌患者的主要治疗方法。本文通过探讨瑞香狼毒和TNF对肺癌相关基因蛋白表达的影响，探寻提高肺癌患者化疗效果的新方法和新途径。现将研究结果报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  中药提取瑞香狼毒采自河北北部，提取前经专家鉴定确认。将瑞香狼毒自然晾干取其根部粉碎，装入容器中加入适量蒸馏水浸泡30 min，加热提取。瑞香狼毒水提药物终浓度为5 g/ml生药。

　　1.2  细胞培养两个肺癌细胞株，即人小细胞肺癌NCI-H446和人非小细胞肺腺癌NCI-H157，购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心。

　　1.3  组化染色

　　1.3.1  免疫组化试剂肺癌耐药蛋白 (LRP)、多药耐药相关蛋白2 (MDM2)、热休克蛋白 27 (HSP 27)均为鼠抗人单克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3.2  药物实验两种肺癌细胞株复苏后在培养瓶中培养至对数生长期，消化计数后移至六孔培养板中继续培养24 h（预先在六孔培养板中置洁净盖玻片）。分3组给药：即瑞香狼毒组、TNF组、(瑞香狼毒和TNF)联合用药组。瑞香狼毒组每孔加入经抽滤的瑞香狼毒水提物20 μl；TNF组每孔加入用培养基稀释的浓度为2.5万U/ml的TNF17 μl ；联合用药组为以上两组药物之和；24 h后检测三种耐药基因蛋白的表达情况，并进行图像分析。

　　1.3.3  免疫组化SP（两步）法经10%甲醛固定后水洗。3%H2O2室温孵育10 min。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，0.05%胰蛋白酶37℃消化30 min。PBS浸泡5 min，10％正常山羊血清封闭，室温孵育10 min。倾去血清，滴加MDM2、LRP、HSP 27一抗工作液，4℃孵育过夜。PBS冲洗，5 min×3次。滴加试剂1(polymer helper），37℃孵育20 min；PBS冲洗，5 min×3次。滴加试剂2(poly peroxidase-anti-mouse/ rabbit IgG)，37℃孵育20 min；PBS冲洗，5 min×3次。DAB显色剂显色。自来水洗，复染，封片，镜检。阳性结果的判定：经DAB显色后阳性目标为棕黄色。　　1.4  观察分析

　　1.4.1  计算方法各组中每种条件3张玻片,每张玻片计数10个视野,再统计每种条件阳性细胞灰度值的均值±s。

　　1.4.2  彩色形态学图像分析系统应用北京航空航天大学图像中心分析软件。

　　1.5  统计学方法

　　用药前后组间样本比较采用t检验。

　　2  结果

    结果见表1～3。表1  瑞香狼毒组两肺癌细胞株中3种基因蛋白表达(辉度)的比较（略）表2  TNF组两肺癌细胞株中3种基因蛋白表达(辉度)的比较（略）表3  联合用药组两肺癌细胞株中3种基因蛋白表达(辉度)的比较（略）

　　3  讨论

    祖国医学典籍中记载瑞香狼毒盛产于河北、山西、四川等地,其性味苦、平、辛、有毒,入肝、肺、脾三经,有逐水、祛痰、破积、杀虫之功效［1］。近年来，国内外学者对瑞香狼毒抗肿瘤方面的功效进行了深入研究，取得了突破性的进展。

    TNF 是由激活的单核巨噬细胞产生的一种可溶性多功能细胞因子,具有很强的抗肿瘤活性［2］。其抗肿瘤机制为:特异性地直接杀伤肿瘤细胞；诱导肿瘤细胞凋亡［3］； 逆转肿瘤细胞多耐药,增加化疗敏感性［3］； 抗肿瘤血管生成［4］； 增加免疫效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用［3］。

    本研究结果显示瑞香狼毒和TNF对两种肺癌细胞株的3种基因蛋白的表达有明显抑制作用，并且联合用药组其抑制蛋白表达的作用明显增强。提示瑞香狼毒和TNF阻断/降低了耐药基因产物的表达，即抑制了基因的活性。

    本研究选用的3种基因蛋白(MDM2、LRP和HSP27)是目前公认的存在于对多种化疗药物耐受的恶性肿瘤中，与多种恶性肿瘤的耐药有关［5～8］。

    国外有研究显示,LRP在非小细胞肺癌中的表达明显高于小细胞肺癌, 这与本研究结果相吻合。MDM2，LRP和HSP27基因及其表达的蛋白质在多药耐药中各自的作用机制及其相互关系十分复杂,目前尚不明确。本研究表明,联合用药组两种肺癌细胞株中3种基因蛋白的表达明显减弱，与用药前相比有显著差异(P<0.05),提示在临床上如果联合这两种药物治疗肺癌可能会提高化疗效果。结果还显示两种肺癌细胞株对瑞香狼毒组和TNF组的反应表现出轻微的差异，个别耐药基因的表达用药前后差异无显著性(P>0.05)，提示尽管在不同病理类型的肺癌细胞中瑞香狼毒提取物和TNF均表现出降低肺癌细胞基因蛋白表达的作用，但其作用机制可能存在着差异，为深入揭示瑞香狼毒和TNF降低肺癌细胞基因蛋白表达的作用机制，还需从基因和蛋白水平进一步研究证实。

【参考文献】
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