尤曼桉叶总黄酮的测定方法和品质鉴别研究

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【摘要】  目的研究尤曼桉叶总黄酮的测定方法和品质鉴别方法。方法用紫外分光光度法、三氯化铝比色法、硝酸铝比色法对四川引种的尤曼桉叶总黄酮进行测定并和高效液相色谱法测定结果进行比较。结果引种的尤曼桉存在叶片甲醇提取液A259/A364≈1.71 和A259/A364≈2.34的两种品质不同的植株，经液相色谱分析其芦丁含量和化学成分有明显区别。A259/A364≈1.71的植株4种方法测定结果差异不大，而A259/A364≈2.34的植株硝酸铝比色法的测定结果分别高出高效液相色谱法和三氯化铝法46.4%，39.9%。结论A259/A364≈2.34植株可能含有干扰硝酸铝比色法的成分。三氯化铝比色法测定尤曼桉叶总黄酮优于紫外分光光度法和硝酸铝法；采用热水提取、紫外分光法和高效液相色谱能很容易地将两类植株的叶片鉴别。

【关键词】  尤曼桉叶； 黄酮； 测定方法； 品质鉴别

　　Study on Determination Methods of Total Flavonoids and Quality Identification about Eucalyptus youmanii Leaves

　　Abstract：ObjectiveTo study the determination methods of total flavonoids and quality identification about Eucalyptus youmanii leaves.MethodsThe content of total flavonoids in leaves of Eucalyptus youmanii which was induced to Sichuan was detected by UV spectrophotometric method, AlCl3 colorimetric method, Al(NO3)3 colorimetric method and HPLC. Comparisons of the four methods were also discussed. ResultsThere were two types with different quality and chemical components in which the A259/A364 of extracting liquid from leaves by methanol was 1.71 and the other one was 2.34. The determination results among the four methods in leaves (A259/A364≈1.71) had no obvious difference but the results by Al(NO3)3 colorimetric method in leaves (A259/A364≈2.34) was preponderate 46.4% and 39.9% over HPLC and AlCl3 colorimetric method. ConclusionThe trees (A259/A364≈2.34) are likely to hold some components disturbing Al(NO3)3 colorimtric method. AlCl3 colorimetric method is superior to UV spectrophotometric method and Al(NO3)3 colorimetric method. The two types are easy distinguished by method of extraction with hot water, UV spectrophotometric method and HPLC.

　　Key words：Eucalyptus Youmanii leaves;  Total flavonoids;  Determination method;  Quality identification
   
　　尤曼桉Eucalyptus youmanii属桃金娘科桉属单蒴盖亚属肾药组树木，四川省林科院于1997年从澳大利亚引种获得成功。其叶片富含芦丁，此外还有桉树素等黄酮类物质［1］，有较大的药用和食用开发价值。本文研究了引种的尤曼桉叶总黄酮的测定方法和品质鉴别方法，旨在为其开发利用提供参考。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器与试剂大连依利特高效液相色谱仪、EC2000色谱工作站；尤尼柯UV－2100分光光度计、索氏抽提器、真空泵、烘箱、控温水浴锅。无水乙醚 、甲醇、三氯化铝、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠，以上试剂均为分析纯。芦丁标准品购自天津尖峰生物科技有限公司（含量98%）。

　　1.2  供试材料的制备

　　1.2.1  树叶提取液的制备尤曼叶片采自雅安名山县1998年从澳大利亚引进尤曼桉种子播种繁殖林。
   
　　取立地条件和长势一致尤曼桉单株（大叶）四株（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ），每株选取位置和长势一致的枝条，摘取下部（1）、中部（2）、上部（3）的绿叶以及上部展开不久的褐色的嫩叶（4）和枝尖嫩叶（5）若干，洗净后60℃干燥5 h，磨碎后过60目筛。

　　1.2.2  样品提取液的制备准确称取制备好的干燥样品0.500 0 g，用滤纸包好，放入索氏抽提器中，用无水乙醚抽提至无色后。换去乙醚，待样品中乙醚挥干后加入90 ml甲醇在90℃抽提5～6 h至无色为止，提取液转入100 ml容量瓶中用甲醇定容制得样品液。

　　1.3  紫外分光光度法、三氯化铝比色法、硝酸铝比色法和高效液相色谱法测定尤曼桉叶总黄酮［2～5］

　　1.3.1  芦丁标准液的配制将芦丁标准品在120℃烘2 h除去芦丁所含的结晶水，准确称取芦丁标准品29.7 mg溶于70 ml微热甲醇中，转入100 ml容量瓶在室温（18℃）下用甲醇定容制得浓度为0.297 mg/ml的芦丁标准液。

　　1.3.2  高效液相色谱条件Hyper ODS2 C18色谱柱，流动相为冰醋酸∶甲醇∶水=3∶49∶48，检测波长UV355 nm,柱温30℃，流速0.8 ml/min。

　　1.3.3  4种方法的回归方程按文献［2～5］的方法进行。根据测定结果，得回归方程：
   
　　Y364＝0.830 76X＋0.005 33  r=0.999 8  （紫外分光光度法）
   
　　Y432 =0.611 59X+0.000 65  r=0.999 9   （三氯化铝法）
   
　　Y500 =2.086 50X+0.005 25  r =0.999 8    （硝酸铝法）
   
　　Y=0.000 594 6X+0.107  r=0.999 9  （液相色谱法）
   
　　从标准曲线可以看出，紫外分光光度法在0.1～1.0 mg/ml的浓度范围内，在259 nm和364 nm处芦丁浓度和吸光度有很好的线性关系。三氯化铝法在0.1～1.0 mg/ml的浓度范围内，在432 nm处芦丁浓度和吸光度有很好的线性关系。硝酸铝法在0.1～2.0 mg/ml的浓度范围内，在500 nm处芦丁浓度和吸光度有很好的线性关系。高效液相色谱法在1.49～7.42 ng/μl范围内，芦丁量和色谱峰面积有很好的线性关系。

　　1.3.4  尤曼桉样品总黄酮含量的测定紫外分光光度法、三氯化铝法、硝酸铝法取样品液适量，加入25 ml容量瓶按标准曲线的方法比色，计算以芦丁计总黄酮含量。
   
　　高效液相色谱进样量为10 μl，以355 nm检测波长纪录的芦丁峰面积和黄酮色谱峰面积总和计算出尤曼桉叶片芦丁的含量和以芦丁计算黄酮含量。　　2  结果

　　2.1  4种方法测定的总黄酮含量的结果比较①高效液相色谱法测定黄酮的专一性强，不受杂质的干扰，目前很多学者将其作为基准方法来判别其它化学方法的准确性。用高效液相色谱法测定总黄酮的含量，一种是对样品的主要黄酮类成分比较清楚，用样品主要黄酮类成分作标样，可以比较准确地测定总黄酮含量。一种是在不完全清楚样品的黄酮成分或缺乏标准样的情况下，根据黄酮类物质在225～280 nm和300～400 nm这两个区域有比较明显的吸收来确定和判别黄酮类物质的色谱峰，以芦丁或槲皮素为标样，以黄酮峰面积之和来计算总黄酮的含量。本实验在比较了样品在255，280，355 nm 3个检测波长的色谱图后，确定了图2中的355 nm检测波长色谱图1，2号峰为黄酮峰，根据他们的面积和来计算黄酮的含量，从中也可以看出尤曼桉叶芦丁占总黄酮的85%～95%左右；②紫外分光光度法也叫标准品直接测定法，通过比较4个单株乙醚抽提后的甲醇提取液的A259/A364的比值发现了存在平均比值分别为1.71和2.34的两种类型单株，同一单株不同生长期、总黄酮含量不同叶片的样品的A259/A364的比值基本保持不变。紫外分光光度法测定的两种单株总黄酮含量与液相色谱法的测定结果平均误差分别为15.4%和10.8%，平均为13.1%，其校正系数分别为0.846和0.892，平均为0.869；③三氯化铝法测定的结果和高效液相色谱法结果非常接近，低于紫外分光光度法。三氯化铝法对两种单株的误差分别为8.7%和4.6%，平均为6.6%，其校正系数为别为0.913和0.954，平均为0.934。因此笔者认为三氯化铝法的测定结果加以校正后能比较准确反应尤曼桉的总黄酮（芦丁）的含量，是比较适宜的方法；④目前常用的硝酸铝法对两种单株的测定的误差差异非常明显，对A259/A364≈1.71的单株的误差仅为6.1%，而对A259/A364≈2.34的单株误差高达46.4%，从液相色谱图上看除芦丁外发现其它含量很高的黄酮类成分，因此可能此类单株含有干扰硝酸铝法测定的非黄酮类成分［6～8］；⑤除硝酸铝法对A259/A364≈2.34的单株外，4种方法测定结果之间有很强的相关性，它们反映尤曼桉总黄酮含量的变动趋势是完全一致的，可根据实验条件选用适当的方法。

　　表1  尤曼桉总黄酮含量4种测定方法的结果和校正系数（略）

　　2.2  尤曼桉叶的品质鉴别从表1还可以看出，尤曼桉叶的芦丁含量差异很大，单株平均含量也有差异。随机选定15株每株选4枝条摘取全部叶片测定平均含量，12株A259/A364≈1.71的单株芦丁平均含量在9%～11.5%之间，而3株A259/A364≈2.34的单株平均含量在4%～6.5%之间,从提取芦丁的角度看其品质有明显差异。由于目前的尤曼桉繁殖还依赖种子繁殖，因此对两种单株进行品质鉴别很有必要。

　　2.2.1  植株原形态鉴别四川引种的尤曼桉共4个种源，其中1个种源的叶片小而细长，其余3个叶片相对较宽，叶较大。小叶的A259/A364≈1.71，芦丁含量在10%左右，而大叶中存在A259/A36≈1.71和A259/A364≈2.34两种单株。其生物学性状没有明显区别，只是A259/A364≈2.34单株的嫩梢颜色稍深，单从性状上来说很难将它们鉴别。

　　2.2.2  热水提取鉴别将两种单株的鲜叶（10 g）或干燥叶（3 g）磨碎后加入100 ml蒸馏水，煮沸20 min后过滤静置冷却到10～15℃，2 h后 A259/A364≈1.71的单株有大量黄色芦丁析出，溶液呈淡黄色；而A259/A364≈2.34的单株未见或极少量芦丁析出，溶液呈黄褐色。静置10 h以上后溶液颜色的差别更明显。结果见图1。

　　2.2.3  紫外分光法鉴别取干燥的两种单株叶细粉各0.01 g于三角瓶中,准确加入50 ml甲醇在超声波提取器上提取30 min，过滤冷却到室温后以甲醇为对照在紫外分光光度计259，364 nm测定吸收值，计算A259/A364的比值加以鉴别。

　　左起1-3为A259/A364≈1.71的单株，4-5为A259/A364≈2.34的单株

　　图1  两种单株的热水提取（静置4 h）鉴别（略）

　　2.2.4  高效液相色谱法鉴别按3.3.1制备提取液，色谱条件：冰醋酸/甲醇/水=3/49/48，检测波长：UV256 nm,流速0.8 ml/min，进样量为10 μl。除芦丁峰高差异明显外，2号峰为A259/A364≈1.71的单株的特征峰，1，2，4，5号峰为A259/A364≈2.34的单株的特征峰，两种单株提取液在检测波长为355 nm时的色谱图没有明显差异。结果见图2。

　　检测波长：256 nm              检测波长：355 nm

　　图2  两种单株叶片提取液的高效液相色谱图（略）

　　3  讨论
   
　　总黄酮的测定方法比较多，但比较常用的是本研究中所用的4种方法。特别是在不清楚样品化学成分的情况下，尤以硝酸铝法运用最多，但其专属性不强。一些非黄酮类物质如原儿茶酸、原儿茶醛、绿原酸等具有邻二位酚羟基结构物质反应后在500 nm处也有吸收［6～8］，A259/A364≈2.34的单株可能也含有这类成分。笔者在用硝酸铝法测定其它几种桉叶总黄酮时也发现其测定值明显高于三氯化铝法，因此在讨论桉叶总黄酮含量时硝酸铝法可能并不适用，当然三氯化铝法在测定其它桉叶总黄酮时的适用性也需验证。对于许多桉叶的黄酮类成分比较清楚，采用高效液相色谱法更为准确。
   
　　根据提取液的色谱图，两种单株的化学成分有明显的不同，A259/A364≈2.34的单株有可能为尤曼桉的一个亚种，或者其它桉树种与尤曼桉的杂交种，甚至有可能为其它桉树种，对其的全面鉴定有待于进一步研究。虽然此单株的黄酮含量相对不高，但笔者研究发现其叶片提取物对金黄色葡萄球菌(Staphy lococcus aureus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌（Escherichiu coli）以及黄瓜枯萎病菌（Fusari-um oxysporum f.sp.cucumerinum）的抗菌活性明显高于A259/A364≈1.71的单株，也高于柠檬桉，与大叶桉的抗菌活性相当，其药用价值值得深入研究。

【参考文献】
  　　［1］ 宋永芳.桉树叶的利用［M］.北京:中国林业出版社,1990：19 .

　　［2］ 紫外分光光度法测定银杏叶提取物中芦丁含量［J］.时珍国医国药，2001，12(3)：204.

　　［3］ 包贝华,张 丽,丁安伟.分光光度法测定荆芥炭中总黄酮的含量［J］.时珍国医国药,2004 ，15（5）：264.

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　　［5］ 付桂明,万茵,周建斌.杜仲叶醇提液中黄酮测定方法的比较研究［J］.中国食品学报,2006,6(1):224.

　　［6］ 上海药物研究所．黄酮体化合物鉴定手册［M］.北京：科学出版社，1981.

　　［7］ 姜淑琴，杨进．黄酮化合物的邻位二羟基显色反应的探讨［J］．药学通报，1980，15（5）：2.

　　［8］ 范莉，王晓强.关于NaNO2－Al(NO3)3－NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨［J］.药物分析杂志，2002，22（2）：97.