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作者：陈瑞娇， 彭珊珊， 王玉珍， 梁汉球
【摘要】 目的测定辣木叶中多糖的含量。方法采用精制辣木叶多糖测得辣木叶多糖对葡萄糖的换算因子后，采用蒽酮-硫酸比色法测定，测定波长为620 nm。结果韶关新丰引种栽培辣木中多糖含量为4.85%,供试液在4 h内显色稳定,平均回收率为 98.72%,RSD＝1.88%(n=4)。结论 此测定方法简便可行,可作为辣木叶中多糖的含量测定方法。
【关键词】 辣木叶； 多糖； 蒽酮硫酸法
Abstract：ObjectiveTo determine the contents of polysaccharide in leaves of Moringa oleifera. MethodsAfter the conversion coefficient of Moringa oleifera polysaccharides to glucose was obtained, contents were determined by anthrone-H2SO4 colorimetry. Wavelength for measurement was 620nm. ResultsThe contents of Polysaccharide in leaves of Moringa oleifera planted in Shaoguan County of Guangdong Province was 4.85%,the color of the treated sample was stable in 4h and average value of the recovery for Polysaccharide measurement was 98.72% with 1.88% of RSD(n=4). ConclusionThe method used in this paper is simple. It can be used for determination of the polysaccharide in leaves of Moringa oleifera.
Key words：Leaves of Moringa oleifera； Polysaccharides ; Anthrone-sulfuricacid method
辣木Moringa oleifera为辣木科辣木属植物，原产于印度北部喜马拉雅区域［1］，全株均可利用，叶、花、豆荚富含蛋白质、维生素A、维生素B6、维生素C、维生素E、叶酸、泛酸及钙、钾、铁等营养成分，不仅是发达国家素食者的理想食物，还是贫穷地区妇女和儿童的天然营养库。印度传统医学认为，辣木叶有护肝、利尿、消炎、止痛、降压、强心、催乳等功效。常用来预防和治疗糖尿病、高血压病、皮肤病、免疫力弱、贫血、坏血病、肥胖症、关节炎、消化器官肿瘤等疾病［2］。
植物多糖是由许多相同或不同的单糖以α或β糖苷键所组成的化合物,普遍存在于自然界植物体中,大量研究表明多糖除了有调节免疫功能、抗肿瘤的生物学效应外,还具有降血糖、降血脂和降胆固醇等生理功能。近年来，辣木在我国广东、云南和海南等都有引种栽培，其活性成分研究和产品的开发成为热点。本文用精制辣木叶多糖测得辣木叶多糖对葡萄糖的换算因子，然后将经90%乙醇处理脱杂后的辣木叶用水提取多糖，蒽酮－硫酸法比色测定，该法准确性好、简便可行。为辣木的合理开发和利用提供了科学依据。
1 材料
1.1 原料辣木叶采自韶关市新丰县东林农业开发有限公司种植场。50℃干燥后，粉碎，过40目筛，备用。
1.2 试剂蒽酮、浓硫酸、无水乙醇、丙酮等均为国产分析纯；葡萄糖对照品为分析纯；AB-8型大孔树脂购于天津南开大学。
1.3 仪器HH-W420数显三用恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；R201旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；SHZ－3循环水真空泵（上海华光仪器仪表厂）；3K18 超速冷冻离心机（美国 Sigma公司）；Ultrospec 2000 紫外/可见分光光度计（Amersham Pharmacia Biotech公司）。
2 方法
2.1 辣木叶多糖的提取与精制称取辣木叶粉60 g，分别加20，15，10倍蒸馏水(w / w)于80℃水浴上提取3次，1.5 h/次，过滤，合并滤液，离心分离（4 000 r/min，4℃，10 min），上清液浓缩至一定体积后，Sevage法除蛋白，反复进行8次至无蛋白层，采用 H2O2氧化法去色素。然后逆流水透析48 h，蒸馏水透析24 h，透析液浓缩，上AB-8型大孔吸附树脂柱，以蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入95%乙醇无沉淀为止。将洗脱液浓缩至小体积后加入无水乙醇使含醇量达到80%，于4℃冰箱中过夜醇沉，再离心分离（4 000 r/min，4℃，10 min），沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤多次，50℃低温干燥至恒重，即得精制辣木叶多糖。称重，计算得率，备用。
2.2 标准曲线的绘制［3］
2.2.1 标准溶液的配制精密称取干燥至恒重的葡萄糖0.100 0 g，以蒸馏水定容至100 ml的容量瓶中，摇匀，精密吸取该溶液10 ml于100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，即得葡萄糖标准液，浓度为0.1 mg/ml。分别精密吸取储备液1，2，3，4，5 ml置10 ml容量瓶中，以蒸馏水稀释定容摇匀，得系列对照品溶液。
2.2.2 蒽酮-硫酸试液的配制取0.2 g蒽酮，加100 ml浓硫酸，置于棕色瓶中，混合摇匀置于冰箱中（现配现用）。
2.2.3 标准曲线的绘制精密吸取上述系列对照品溶液1 ml ，置于10 ml具塞试管中，冰水浴5 min，加入0.2%硫酸蒽酮试液4ml摇匀，立即置于沸水浴加热10 min，取出用冷水冷却至室温，室温放置10 min左右，于620 nm处测定吸收度，另精密吸取蒸馏水1 ml，同法操作，作为空白对照。以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖对照品浓度（C）为横坐标，得葡萄糖标准曲线(见图1)，线性回归得回归方程A = 5.811 4C + 0.002 4，相关系数r =0.999 0。
图1 葡萄糖标准曲线（略）
2.3 换算因子的测定精密称取干燥至恒重的精制辣木叶多糖0.010 0 g,用水溶解于100 ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀得精制辣木叶多糖贮备液，精密吸取精制多糖贮备液1ml,蒽酮-硫酸法测定其吸光度（A），从回归方程求出精制辣木叶多糖贮备液中葡萄糖浓度,按下式计算换算因子。
换算因子 f =W /（C·D）
式中：W为称取多糖的重量(mg),C为精制辣木叶多糖贮备液中葡萄糖浓度（mg/ml）,D为多糖的稀释倍数。 2.4 样品中辣木叶多糖的含量测定
2.4.1 样品溶液的制备准确称取40目辣木叶粉末1.000 g，置索氏提取器中，加入90%乙醇回流提取7 h,药渣挥尽乙醇，连同滤纸于烧瓶中，加蒸馏水250 ml,80℃水浴加热提取1.5 h，趁热过滤，残渣用80℃热蒸馏水洗涤3次，洗液并入滤液中，冷却后移入500 ml容量瓶定容。
2.4.2 样品溶液中辣木叶多糖含量测定精密吸取2.4.1所得样品溶液1 ml，用蒽酮-硫酸法测吸光度（A）。由回归方程计算供试液中葡萄糖浓度（C），按下式计算样品中辣木叶多糖含量。
辣木叶多糖含量（%）=C×D×fW×1000×100%
式中：C为样品溶液中葡萄糖浓度(mg/ml),D为样品溶液的稀释倍数，f为换算因子,W为供试辣木叶的重量(g)。
2.5 稳定性实验精密吸取按2.4.1项下方法制备的样品溶液1 ml，按照2.2.3项下的方法测定吸光度（A），每隔1 h测定1次，连续4 h考察其稳定性。
2.6 加样回收率测定精密吸取同批4份已知含量的辣木叶粉末（过40目筛）各1 g，精密加入精制多糖样品5 mg，然后按2.4.1项样品液的制备和2.2.3标准曲线项下方法测定吸收度（A），根据2.4.2项中得出的结果辣木叶中多糖的含量为4.85%，计算回收率。
3 结果
3.1 精制辣木叶多糖的得率 60 g干燥的辣木叶粉末制得精制辣木叶多糖（1.505±0.088）g，得率为 （2.508±0.147）%（n＝4）。
3.2 换算因子 f =3.13。
3.3 辣木叶多糖含量的测定结果 测得该辣木叶样品中多糖含量为4.85%。
3.4 稳定性实验 测定结果见表1。结果表明样品溶液在4 h内显色基本稳定，其吸光度相对标准偏差RSD =4.31%。
3.5 加样回收率 结果见表2。
4 讨论
蒽酮硫酸法是测定多糖含量的经典方法，本实验首先用90%乙醇回流以除去单糖、低聚糖、生物碱、苷类及其它醇溶性的干扰成分，再用水提取多糖成分。蒽酮－硫酸法测定辣木叶多糖的原理是辣木叶多糖在浓硫酸的作用下，先水解为单糖，迅速脱水形成糠醛衍生物，其与蒽酮缩合为蓝色化合物，该化合物颜色深浅与糖的浓度成正比。在620 nm处有特征吸收。本法简单，且供试液在4h内显色稳定,灵敏度高。
表1 辣木叶多糖含量测定稳定性实验结果（略）
表2 加样回收率测定结果（略）
在多糖含量测定中，得到相应多糖对照品较困难，因多糖组成比较复杂，往往采用单糖如葡萄糖代替对照品，测定样品多糖的相对含量。本实验中采用Sevage法除蛋白，H2O2氧化法去色素，利用AB8型大孔吸附树脂柱对多糖进行纯化，获得比较纯净的多糖。然后用精制多糖计算葡萄糖与辣木叶多糖的换算因子，这样可避免用葡萄糖做标准引起的系统误差，结果准确真实。
研究结果表明，韶关新丰引种栽培的辣木中多糖含量为4.85%。张涛等［5］采用苯酚－硫酸分光光度法测定辣木中多糖含量为15.36%，其测定结果与本研究有较大差异，原因可能与测定方法、辣木产地、辣木叶采集时间、采集部位等因素有关。
【参考文献】
［1］ 刘昌芬，李国华.辣木的研究现状及其开发前景［J］.云南热作物科技，2002，25（3）：20.
［2］ 张燕平,段琼芬,苏建荣. 辣木的开发与利用［J］.热带农业科学，2004，24(4)：42.
［3］ 张 涛,马海乐,钟慧慧. 分光光度法测定辣木多糖含量［J］.粮油食品科技，2004，12（1）：32. |
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发表于 2014-8-17 21:52:04
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