高效液相色谱法测定沉香药材中两种活性成分的含量

amy54321 · 发表于 2014-8-17 21:53:06

【摘要】  目的建立高效液相色谱法测定沉香药材中6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A），6羟基2(2苯乙基)色酮（B）2种活性成分的含量。方法采用HPLC法，色谱柱为DiamonsilTMRP18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相为乙腈甲醇水（27∶27∶46），流速0.8 ml·min-1；柱温35℃；检测波长226 nm。结果 6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）在0.070 8～0.354 mg范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为97.75%， RSD为1.14%；6羟基2(2苯乙基)色酮（B）在0. 232 mg～16 mg范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为98.40%，RSD为1.29%。结论该方法简便、准确，可用于沉香药材中6-羟基-2-［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）和6羟基2（2苯乙基)色酮（B）的含量测定。

【关键词】  沉香 6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮； 6羟基2(2苯乙基)色酮；高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo  establish an HPLC  method  for  the  determination  of  6hydroxy2［2-（4'methoxylphenyl）ethyl］ chromone  and  6hydroxy2（2phenylethyl） chromone in Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg.MethodsThe  determination  was  performed  on  a  DiamonsilTMRP-18  column. The  mobile  phase was  acetonitrile-methanol-water solution（27∶27∶46） and  UV  detection wavelength  was  at  226 nm. The  flow  rate  was 0.8 ml·min-1 and  the  column  temperature was at 35℃.  Results The  linear  ranges of  6-hydroxy2［2（4'methoxylphenyl）ethyl］ chromone and  6hydroxy2（2phenylethyl） chromone  were  0. 070 8～0.354 mg(r=0.999 8), 0. 232～1.16 mg(r=0.999 7) , respectively . The average recovery rates were 97.75% (RSD=1.14%), 98.40%(RSD=1.29%) respectively.Conclusion This  method  is  simple,  accurate  and  can be used  to determine the contents of    6- hydroxy2［2（4'methoxylphenyl）ethyl］chromone（A）  and  6hydroxy2（2phenylethyl） chromone（B）  in Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg.

　　Key words：Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg；  6hydroxy2［2（4'methoxylphenyl）ethyl］ chromone； 6hydroxy2（2phenylethyl） chromone； HPLC

　　沉香为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg含有树脂的木材［1］，又名土沉香、女儿香、莞香、海南沉香等，主产于广东、广西、海南、台湾等地。主要含有挥发油和色酮类成分，具有镇静、止痛、收敛、祛风的功效［2］，临床用于治疗寒性胃痛、老年性肠梗阻、便秘、哮喘等［3］，是我国、日本、印度以及其他东南亚国家的传统天然香料和名贵中药材。在现有的文献资料中，对沉香所含的挥发油部位研究较多，而针对色酮类活性成分的研究却不多见，本文是在系统研究沉香色酮类化学成分的基础上，首次针对含量较高的6羟基2［2(4’甲氧基苯乙基)］色酮、6羟基2(2苯乙基)色酮成分进行了含量测定，以期为进一步研究沉香中的色酮类成分以及合理开发沉香这一名贵中药提供参考。

　　1  仪器与试药

　　岛津LC10AT高效液相色谱仪，Sartorius电子分析天平，超声波清洗仪，乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）和6-羟基2(2苯乙基)色酮（B）对照品均为本人从沉香药材中分离得到。经面积归一化法标定其纯度分别为99.2%和99.0%；沉香药材由广州君元药业有限公司提供，由广州中医药大学中药资源教研室徐鸿华教授鉴定为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg含有树脂的木材。

　　2  方法与结果

　　2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱DiamonsilTMRP18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相为乙腈甲醇水（27∶27∶46），流速为0.8 ml·min-1；柱温35℃；检测波长226 nm；理论塔板数按6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮峰计算应不低于3 000，按6羟基2(2苯乙基)色酮峰计算应不低于2 500。

　　在上述色谱条件下，6羟基2-［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮、6羟基2(2苯乙基)色酮的保留时间分别为20 min和21 min；并且分离度良好。混合对照品和样品的高效液相色谱图见图1～2。

　　2.2 供试品溶液的制备取沉香药材粉末0.25 g，精密称定，置250 ml圆底烧瓶中，加甲醇60 ml，水浴加热回流提取1 h，提取液置水浴上蒸干，残渣加5%碳酸氢钠溶液25 ml，分别加乙醚25，20，20 m l提取3次，合并乙醚提取液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 mm）滤过，取续滤液，即得。

　　图1  混合对照品色谱图（略）

　　图2  样品色谱图（略）

　　2.3 标准曲线的制备精密称取6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）对照品适量，加甲醇溶解并定容至10 ml，摇匀，制成每毫升含6-羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）0.118 mg的对照品溶液。同法制成每毫升含6羟基2(2苯乙基)色酮（B）0.232 mg的对照品溶液。两种溶液以适当比例混合，稀释，制成浓度为每毫升含A 0.035 4 mg，B 0.116 mg；为每毫升含A 0.028 32，B 0.092 8 mg；为每毫升含A 0.021 24 mg，B 0.069 6 mg；为每毫升含A 0.014 16 mg，B 0.046 4 mg；为每毫升含A 0.007 08 mg，B 0.023 2 mg的混合对照品溶液。分别精密吸取上述混合对照品溶液各10 ml进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品量为横坐标进行线性回归，求得回归方程为：

　　6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］线性方程：YA=2 792 755.65XA+31 376.1，rA=0.999 8，结果表明对照品在0. 070 8～0.354  mg范围内与峰面积呈现良好的线性关系。
　　6羟基2(2苯乙基)色酮（B）线性方程：YB=1 258 315.517XB+69 314.8；rB=0.999 7，结果表明对照品在0. 232～1.16 mg范围内与峰面积呈现良好的线性关系。
　　2.4 精密度实验精密吸取浓度为0.01416 mg/ml的6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）和浓度为0.0464 mg/ml的6羟基2(2苯乙基)色酮（B）混合对照品溶液10 ml，重复进样10次，记录峰面积并计算，结果6羟基2-［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）峰面积的平均值为430 071，RSD为1.97%，6羟基2（2苯乙基)色酮（B）峰面积的平均值为661 287，RSD为1.50%，表明仪器精密度良好。

　　2.5  稳定性实验精密吸取同一供试品溶液，依上述色谱条件，分别于0，1，2，4，8，12，24，48 h各进样10 ml，记录峰面积，结果6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）、6-羟基2（2苯乙基)色酮（B）峰面积的RSD分别为1.69%，1.04%（n=8）,表明供试品溶液在48 h内稳定。

　　2.6  重复性实验取5份同批次沉香药材粉末各0.25 g，分别精密称定后，按供试品溶液的制备方法制备，照上述色谱条件各进样10 ml测定，结果6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）平均含量为0.602 mg·g-1，RSD为0.71%，6羟基2(2苯乙基)色酮（B）平均含量为1.007 mg·g-1，RSD为1.34%。

　　2.7  加样回收率实验取5份已知含量的沉香药材粉末各约0.125 g，精密称定后，分别精密加入一定量的 6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）、6羟基2(2苯乙基)色酮（B）对照品。按供试品溶液制备项下方法制备并测定，计算回收率，结果6羟基2-［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A的平均回收率为97.75%，RSD为1.14%（n=5），6-羟基2(2苯乙基)色酮（B）的平均回收率为98.40%，RSD为1.29%（n=5）。

　　2.8  样品测定取不同批次商品沉香药材粗粉0.25g（n=2），分别精密称定后，按2.2项下操作，进样测定，计算不同批次商品沉香药材中的6羟基2［2（4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）和6羟基2(2苯乙基)色酮（B）的含量。结果如表1。

　　表1  沉香药材含量测定结果（略）

　　3  讨论

　　采取正交试验设计筛选并确定最佳的提取方法，以6羟基2-［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）和6羟基2(2苯乙基)色酮（B）的峰面积作为考察指标，分别考察不同的提取方式（超声提取法、水浴加热回流法）、不同溶媒种类（甲醇、95%乙醇、氯仿）、不同溶媒体积（30，45，60 ml）、不同提取时间（30，45 ，60 min）对两指标成分含量的影响，以两成分权重各占50%计算，比较最佳提取条件。结果表明提取方式对实验结果影响较小，可忽略；提取溶剂和提取时间对实验结果影响较大。用甲醇60 ml加热回流提取60 min可以获得最佳提取效果。

　　6羟基2［2(4'甲氧基苯乙基)］色酮（A）和6羟基2(2苯乙基)色酮（B）均在226 nm处有最大吸收，因此选择226nm为检测波长。对流动相的选择，经过了反复摸索，考察了甲醇水，乙腈水不同比例的洗脱效果，结果乙腈甲醇水（27∶27∶46）等度洗脱效果最好。

【参考文献】
  　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005.

　　［2］林伟强，贺立静，谢正生. 一种值得推广的优良园林树种——白木香［J］.广东园林，2002，4：38.

　　［3］肖培根. 新编中药志，第3卷［M］.北京：化学工业出版社， 2002：44.

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